O soro de queijo, um subproduto industrial altamente poluidor, constitui-se em um substrato rico em nutrientes e de grande potencial de aproveitamento em bioprocessos. A bioconversão da lactose do soro de leite em etanol por micro-organismos capazes de metabolizar tal dissacarídeo, representa uma alternativa promissora para o tratamento e disposição do mesmo, pois além de se obter uma redução expressiva da DQO, é possível gerar um bioproduto de importância comercial, como no caso etanol. Neste sentido a seleção de micro-organismos que consigam metabolizar a lactose e produzir o etanol é de grande importância. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a varialbilidade genética de leveduras que fermentam a lactose. Para isso foram avaliadas 2 leveduras da espécie Kluyveromyces marxianus ( Km 1821 e Km CCT 3172) e 2 da espécie Saccharomyces fragilis ( S.f IZ 275 e Sf 7586 ) utilizando-se 10 oligonucleotídeos RAPD (random amplification polimorfism). As análises de similaridade genética e a árvore filogenética foram realizadas com o auxílio do Programa NYTSYS utilizando cefieciente de Jaccard. Os marcadores RAPD detectaram um baixo grau de polimorfismo genético, produzindo 25 bandas, com pouca variabilidade intraespecífica, mas formando dois grupos nitidamente separados, com 0.3 de coeficiente de similaridade entre o grupo das cepas produtoras de etanol a partir da lactose (K. marxianus e S. fragilis) e das não produtoras (S. cerevisae). Isso indica que estes dados foram úteis para seleção de cepas produtoras de etanol, podendo essa metodologia ser utilizada para caracterização de leveduras produtoras de etanol que utilizam a lactose como substrato.