As pesquisas com produtos secundários com ação antimicrobiana vêm aumentando no mundo todo com diversos gêneros vegetais de uso alimentar. O objetivo deste estudo foi avaliar a existência de efeito antibacteriano in vitro de extrato hexânico das sementes do urucum – Bixa orellana. Foram utilizadas Salmonella enteritidis (ATCC 13076), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923). As sementes em pó foram submetidas ao extrator hexano (5 vezes, intervalo 2 dias). O extrato puro foi obtido em rotaevaporador (-600 mmHg a 50ºC). A ação da atividade antibacteriana foi avaliada por meio da inoculação pela técnica de macrodiluição em tubos (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Sixth Edition. NCCLS document M7-A6). Foram realizadas nove diluições do extrato bruto, em triplicata, a partir de 12,5 mL de Tweem 80 (2%) e 12,5 g de extrato bruto. A segunda diluição foi preparada com 4 mL da primeira e 4 mL de Caldo Mueller Hinton obtendo-se a concentração de 250,0 mg mL-1 e, desta, as demais até 1,9 mg mL-1. Cada diluição recebeu 50 µL da solução de células bacterianas que foi ajustado na escala padronizada 0,5 de Mc Farland (1,5x108 células mL-1). A CIM foi obtida na concentração de 1,9 mg mL-1 contra S. aureus, E. coli, S. enteritidis e E. aerogenes. O teste de macrodiluição desenvolvido para avaliar a atividade antibacteriana in vitro com extrato hexânico das sementes de B. orellana sinaliza capacidade inibitória do crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.