A presença de leite ou derivados deve ser identificada nos rótulos de alimentos para garantir a segurança de consumidores alérgicos a este alimento. Misturas para bolo são compostas por vários ingredientes, sendo susceptíveis a contaminações cruzadas. Assim, métodos que detectam alérgenos em quantidades traços precisam ser validados para garantir a confiabilidade dos resultados analíticos subsidiando Programas de Controle de Alérgenos e ações de fiscalização. O objetivo deste trabalho foi validar um kit imunoenzimático de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para determinação de proteínas do leite em misturas para bolo. Realizou-se levantamento de misturas para bolo em websites, para identificação dos principais ingredientes e produção de formulações representativas. Estratégias quantitativas e qualitativas foram empregadas na validação por adição na mistura para bolo selecionada de 7 níveis de concentração (0,625; 1,25; 2,5; 5,0; 7,5; 12,5; 30;0 mg/kg) do padrão de proteína de leite em pó previamente caracterizado em 10 replicatas cada. Encontrou-se 126 misturas para bolo sendo a farinha de trigo enriquecida com ferro e ácido fólico, açúcar refinado, gordura vegetal hidrogenada e fermento químico os ingredientes prevalentes. Dentre as formulações avaliadas, Sultan’s Yellow foi a que mais aproximou das comerciais. Na abordagem quantitativa, médias de recuperação aceitáveis (50 a 150%) foram evidenciadas apenas no nível 30 mg/kg. Na abordagem qualitativa, taxas de falsos negativos (TFN) de 0% e taxas de sensibilidade (TSB) de 100% foram evidenciadas em todos os níveis acima de 2,5 mg/kg. Valores de 30 e 100% de TFN e 70% e 0% de TSB foram obtidos para os níveis 1,25 e 0,625 mg/kg, respectivamente. Valores de acordância de 100% foram calculados em todos os níveis estudados, exceto 1,25 mg/kg. Há evidências de que o método não seja adequado com propósitos quantitativos. Na abordagem qualitativa, o método apresentou resultados satisfatórios em termos de seletividade, sensibilidade, taxas de falsos resultados e precisão.