Pseudomonas fluorecens é uma bactéria psicotrófica, comumente isolada do leite cru, que produz enzimas extracelulares termorresistentes. Objetivou-se expressar a protease AprX de P. fluorecens 041 em Escherichia coli e caracterizar essa enzima quanto ao pH e temperatura de ação. O gene que codifica a protease AprX foi previamente clonado em E. coli XL1-Blue e a bactéria ativada em meio de cultura dYT adicionado de ampicilina sob agitação a 37 °C até alcançar densidade óptica de 0,5 em espectrofotômetro a 600 nm, sendo, então, adicionado Isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) para induzir a expressão gênica. Posteriormente, obteve-se o pellet celular por centrifugação a 10.000 g/30 min., seguida de lavagens sucessivas em Tris-HCL 50 mM e NaCl 150 mM. Então, o pellet limpo foi submetido ao rompimento celular com utilização de tampão de lise, esferas de vidro e força mecânica. Para otimizar o processo de rompimento das células realizou-se sucessivos choques térmicos, sendo adicionado durante esta etapa tampão fosfato de sódio 50 mM. O sobrenadante enzimático obtido foi utilizado para determinação de atividade enzimática, a qual foi realizada a 37 °C por 12 horas e para a caracterização bioquímica da enzima com variação da temperatura de 5 °C a 70 °C e do pH de 6,0 a 9,0, utilizando-se como substrato azocaseína a 2%. A maior atividade enzimática se deu a 40 °C. Além disso, a enzima apresentou atividade remanescente de 51% na temperatura de 5 °C e de 5% a 70 °C. A maior atividade da enzima foi em pH 8,0, confirmando sua natureza alcalina, e no pH 6,0 e 9,0 a mesma apresentou, respectivamente, 61% e 12% da sua atividade remanescente. Portanto, essa protease apresentou atividade em temperaturas de refrigeração, em valores de pH do leite cru e resistiu a temperaturas elevadas, o que a torna um problema nos laticínios.