Amido resistente (AR) é definido como a soma do amido e produtos de sua degradação não digeridos pelas enzimas digestivas do trato gastrointestinal. O AR tipo 3 (AR3) consiste em polímeros de amido retrogradado, principalmente amilose, que são produzidos após resfriamento do amido gelatinizado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da desramificação do amido com pululanase na obtenção de AR3 a partir de amidos obtidos de duas linhagens de batata. Amidos das linhagens IAC Ibituaçu e IAC Vitória foram isolados e caracterizados quanto ao teor de amilose e distribuição do comprimento das cadeias ramificadas da amilopectina. Suspensões de amido 6,5% (m/v) foram gelatinizadas, desramificadas com pululanase (40 U/g Promozyme 400L, Novozyme, Dinamarca) durante 10 h, autoclavadas a 121 °C por 30 min, refrigeradas a 4 °C por 16 h. O amido desramificado foi precipitado com etanol e liofilizado. Os teores de AR3 foram determinados nos amidos retrogradados. Os teores de amilose nos amidos de batata das linhagens IAC Ibituaçu e IAC Vitória foram 16,76 e 20,36%, respectivamente. Ambos os amidos apresentaram alta proporção de cadeias longas da amilopectina (DP ≥ 37), porém o amido da linhagem IAC Ibituaçu teve menor proporção dessas cadeias (12,85%). Os teores de AR dos amidos de batata das linhagens IAC Ibituaçu e IAC Vitória foram 6,38 e 8,36 %, respectivamente, e aumentaram após retrogradação para 13,13 e 17,52%. O maior teor de amilose presente no amido da variedade IAC Vitória contribuiu para o maior teor de AR3 neste amido. A desramificação com pululanase provocou aumento significativo nos teores de AR3 que atingiu 27,12 e 24,96 % para os amidos das linhagens IAC Ibituaçu e IAC Vitória, respectivamente, sugerindo que além da amilose, os comprimentos das cadeias laterais da amilopectina influenciam na formação de AR3 quando o amido é submetido à desramificação.