Alicyclobacillus spp. são micro-organismos frequentemente relacionados à deterioração de produtos ácidos, como bebidas e sucos cítricos. Papaína e bromelina são enzimas proteolíticas derivadas do mamão e do abacaxi, respectivamente. Existe uma ampla utilização dessas enzimas na medicina, nas indústrias farmacêutica e alimentícia, sendo que alguns estudos demonstram sua ação antibacteriana, no entanto, não existem estudos relacionados ao gênero Alicyclobacillus spp. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana da papaína e da bromelina em espécies de Alicyclobacillus spp.. O efeito antibacteriano foi determinado através da concentração inibitória e bactericida mínimas (MIC e MBC). A melhor atividade encontrada foi da papaína, sendo que a concentração inibitória variou de 0,98 µg/mL a 3,91 µg/mL entre as cinco cepas de Alicyclobacillus spp. avaliadas, caracterizando uma boa atividade inibitória. O mesmo ocorreu com a atividade bactericida, pois as concentrações variaram de 3,91 µg/mL a 15,60 µg/mL entre as cepas, sendo que o equivalente a aproximadamente quatro vezes a concentração inibitória mínima foi suficiente para eliminar as cepas avaliadas. Para a enzima bromelina foram encontradas concentrações com uma boa atividade inibitória, variando de 15,6 µg/mL a 62,5 µg/mL entre as cepas, exceto para a cepa A. acidocaldarius, onde a concentração inibitória foi de 500 µg/mL, considerada uma atividade de inibição moderada a fraca. A concentração bactericida de bromelina para as cepas variou de 62,5 µg/mL a 1000 µg/mL. Não existem estudos de ação antibacteriana utilizando as enzimas purificadas (papaína ou bromelina), apenas estudos com extratos do fruto ou da planta. As enzimas papaína e bromelina apresentaram uma boa atividade inibitória e bactericida para as espécies de Alicyclobacillus spp. avaliadas. Os baixos valores de MIC e MBC encontrados para a espécie A. acidoterrestris, que é a espécie mais relacionada com deterioração de sucos cítricos é um aspecto de grande relevância para a indústria.