Biofilme é definido como uma comunidade de micro-organismos formados por uma ou várias espécies fixos em diferentes superfícies, como o aço inoxidável, utilizados nas indústrias de alimentos. Staphylococcus aureus, patógeno envolvido em surtos e considerado o segundo causador de doenças transmitidas por alimentos no Brasil, foi escolhido neste estudo. O objetivo do trabalho foi verificar a influência de diferentes substratos na formação de biofilme de S. aureus de origem láctea em aço inoxidável. Cupons de aço inoxidável foram imersos em diferentes substratos: caldo infusão de cérebro e coração (BHI), soro de leite (SL) e leite desnatado (LD), contendo 103 UFC/ml e mantidos a 25C. As contagens de S. aureus foram realizadas pela técnica do plaqueamento superficial em MSA (Agar Manitol Sal), após 6h, 24h, 48h, 96h, 168h e 240h. Após 6h, o patógeno aderiu em todos os substratos, porém com maior adesão no LD, com contagem de 2,51 log UFC/cm2. As maiores contagens foram observadas após 168h para os substratos BHI e LD, com valores de 5,72 e 6,31 log UFC/cm2, respectivamente. No SL a maior contagem, 4,69 log UFC/cm2, ocorreu após 96h. O desprendimento de células do biofilme foi observado somente com 240h para BHI e SL. No LD a redução brusca de células coincidiu com a queda do pH; o primeiro desprendimento ocorreu em 96h com 2,87 ciclos log de redução e pH 4,5 e o segundo em 240h com 4,91log de redução. As células desprendidas são importantes fontes na disseminação da contaminação dos alimentos durante o processamento. O BHI e o LD proporcionaram melhores condições para adesão e formação de biofilme de S. aureus em superfície de aço inoxidável. Assim, um adequado processo de limpeza para remoção de todos os resíduos de leite é essencial para evitar a formação de biofilmes.