Hidrolisados proteicos têm inúmeras aplicações, como suplementação para indivíduos com necessidades específicas e em dietas hipoalergênicas. O uso de enzimas imobilizadas traz vantagens para a produção de hidrolisados, como aumento da estabilidade enzimática, prevenção de autólise e reutilização. Neste trabalho, a enzima Alcalase foi imobilizada em glioxil-agarose e a estabilidade térmica e a reutilização foram avaliadas por testes de atividade enzimática. Isolado proteico do soro de leite foi utilizado como substrato (1,2% m/m) e a atividade enzimática foi avaliada a 60°C/ pH 8. A reação foi interrompida por adição de ácido tricloroacético (TCA) em concentração final de 8% e a absorbância do sobrenadante determinada a 280 nm. O rendimento de imobilização foi de 23% e a retenção da atividade 85%. A enzima imobilizada manteve 15% de sua atividade inicial em 90 min de incubação a 65°C, enquanto que a enzima livre perdeu totalmente a atividade em 60 min. Houve aumento gradual da atividade com os 6 ensaios de reuso da enzima imobilizada (23%) Esse comportamento possivelmente está associado às modificações estruturais que permitiram maior contato entre os sítios ativos da enzima e o substrato à medida que os reusos foram realizados. A imobilização em glioxil-agarose aumentou a estabilidade térmica da Alcalase, o que pode viabilizar a hidrólise em condições que minimizam o crescimento microbiano. Além disso, possibilita que a enzima seja retirada do produto final e reutilizada várias vezes sem perda da atividade, sendo, portanto, de grande importância na produção de hidrolisados para fins alimentícios.