Introdução: A β-lactoglobulina (β-lg) é uma proteína capaz de interagir com diversas moléculas. Adicionalmente, a β-lg é sensível à desnaturação térmica, sendo importante estudar o efeito da sua conformação nos parâmetros termodinâmicos de formação de complexo com moléculas de interesse na área de alimentos. Objetivo: Neste trabalho, objetivou-se determinar os parâmetros termodinâmicos da interação entre β-lg nativa e desnaturada com cafeína (caf), utilizando a espectroscopia de fluorescência. Metodologia: Soluções de β-lg (5,0x10-6 mol.L-1) e cafeína (0 a 7,25 x 10-5 mol.L-1) foram preparadas em tampão fosfato de potássio (pH 7,0). Para os experimentos com a proteína desnaturada, a proteína foi mantida a 80 °C por 15 min. A proteína foi excitada a 295 nm, nas temperaturas de 20, 25, 30, 35 e 40 °C. Resultados: Complexos β-lg-caf, de estequiometria 1:1, foram formados para a proteína nativa e desnaturada, com constantes de interação da ordem de 103 L.mol-1. Foram determinadas as variações padrão de energia livre de Gibbs (∆G°), entalpia (∆H°) e entropia (∆S°). Os valores negativos de ∆G° (ΔG°médio, β-lg nativa = -19,95 kJ.mol-1; ΔG°médio, β-lg desnaturada = -19,47 kJ.mol-1) indicaram que o equilíbrio químico favoreceu a formação dos complexos. Os valores de ∆H° e T∆S° (ΔH° = -14,79 a -1,56 kJ.mol-1; TΔS° = 4,94 a 18,75 kJ.mol-1) indicaram que o processo de formação do complexo foi conduzido entalpicamente e entropicamente para a proteína nativa. Para a proteína desnaturada, a formação de complexo foi entalpicamente dirigida (ΔH° = -30,24 a -7,15 kJ.mol-1) nas temperaturas de 25, 30 e 35 °C e entropicamente dirigida nas temperaturas de 20, 35 e 40 °C. As forças de van der Waals, as ligações de hidrogênio e as interações hidrofóbicas foram importantes para a formação dos complexos. A relação TΔS° versus ΔH° foi linear com coeficiente angular aproximadamente igual a 1, sugerindo a ocorrência de compensação entálpica-entrópica para a formação do complexo β-lg-caf para as proteínas em ambas as conformações. Conclusão: O estudo revelou a natureza da interação β-lg-caf e demonstrou que a conformação da proteína altera a termodinâmica de formação dos complexos, contribuindo para o aprimoramento de sua aplicação em formulações de interesse.