USE OF Amynthas gracilis HEMOGLOBIN AS A POTENTIAL BIOSENSOR FOR ENVIRONMENTAL CONTAMINATION

A contaminação por metais pesados representa um desafio ambiental significativo, exigindo métodos de detecção eficientes e econômicos para aplicações de monitoramento ambiental. Este estudo investigou o potencial da hemoglobina extracelular de Amynthas gracilis (HbAg) como um biossensor óptico inovador para detecção de cobre em amostras ambientais. A HbAg foi extraída por meio de incisão dorsal em aproximadamente 60 exemplares encontrados comercialmente. Os animais foram crioanestésicos sistematicamente e posteriormente fixados em placas de cera para procedimentos padronizados de remoção. A hemolinfa foi cuidadosamente coletada utilizando micropipetas com solução de citrato de sódio (0,1 mol.L⁻¹) para evitar a coagulação durante o processo de remoção. Protocolos abrangentes de purificação envolveram centrifugação sequencial a 12.000 RPM, diálise em seletiva Tris-HCl 100 mmol.L⁻¹ (pH 7,0), ultracentrifugação a 54.000 RPM por 6 horas e cromatografia líquida de exclusão de tamanho usando coluna HiLoad® 16/600 Superdex® 200 pg para isolamento ideal de tamanho. Os bioensaios consistiram na adição sistemática de CuSO₄ em concentrações crescentes (0-100 μmol.L⁻¹) a soluções de proteínas purificadas (0,1 mg.mL⁻¹) em acetato-borato-fosfato 30 mmol.L⁻¹ em pH 7,0 e 9,0. Análises abrangentes foram realizadas utilizando espectrofotometria UV-Vis, espectroscopia de fluorescência, técnicas de intensidade de propagação de luz (LSI) e dispersão dinâmica de luz (DLS). Os resultados respondidos de sensibilidade diferenciais significativamente dependentes do pH. Em pH 7,0, a HbAg manteve a estabilidade estrutural até 30 μmol.L⁻¹ CuSO₄ após 1 hora de incubação, enquanto em pH 9,0, mudanças estruturais detectáveis ocorreram em concentrações tão baixas quanto 5 μmol.L⁻¹. As interações cobre-proteína promoveram a pressão azul específica da banda de Soret de 415 nm para comprimentos de onda mais curtos, redução da intensidade da banda Q e aumento da intensidade da fluorescência (aumento de 2,0 vezes em pH 9,0 e 1,4 vezes em pH 7,0). À medida que o DLS aumentou significativamente, diminuiu a formação de agregados de proteína-metal e confirmando alterações no diâmetro cerâmico hidrodinâmico com maior polidispersão em concentrações elevadas de cobre. Condições de pH 9,0 proporcionam sensibilidade analítica superior, enquanto pH 7,0 proporcionam maior estabilidade estrutural para durabilidade. Esses resultados demonstram a técnica da HbAg como um elemento biorreceptor eficaz em biossensores ópticos para monitoramento de contaminação ambiental por cobre, apresentando potencial significativo de aplicação em campo devido à disponibilidade de espécies e métodos de extração relativamente simples.