A espécie vegetal Eugenia biflora (L.) DC., conhecida popularmente como pedra-ume-caá, tem sido utilizada na medicina popular brasileira na forma de infusão (folhas) para o tratamento do diabetes. Tendo em vista, a necessidade do estudo químico e da comprovação do uso popular, as folhas dessa espécie foram coletadas na Área de Proteção Ambiental de Algodoal, Maracanã (PA). A infusão das folhas secas trituradas (m/v) foi seca por spray drying. A identificação dos constituintes foi realizada por LC-qTOF-MS/MS e RMN 1D e 2D. Ademais, foram realizados estudos in vitro para determinar os potenciais antioxidante, antiglicante e enzimático (alfa-glicosidase), bem como o ensaio de tolerância oral a carboidratos em modelo experimental in vivo. Onze constituintes químicos foram identificados, sendo o ácido quínico e 10 compostos fenólicos (procianidina tipo B, catequina, catequina-3-O-galato, miricetina-3-O-glicosídeo, miricetina-3-O-(2’’-O-galoil)-alfa-ramnosídeo, miricitrina, guaijaverina, quercitrina, isoramnetina-3-O-glicosídeo e ácido metil elágico ramnosídeo). Concernente ao estudo farmacológico, o extrato de E. biflora inibe a glicação pela Via Não Oxidativa (CI50 22,2 ± 1,2 ug mL-1) com resposta superior ao padrão aminoguanidina (CI50 37,6 ± 0,03 ug mL−1). Além disso, o teor de fenóis totais (263,2 ± 1,9 mg GAE g-1), associado às elevadas atividades antioxidantes indicadas pelos métodos DPPH● (1475,0 ± 4,7 umol TE g-1), ABTS●+ (982,0 ± 23,6 umol TE g-1) e atividade antioxidante celular (65,53% ± 3,5 ug mL-1, 100 ug mL-1) revelam um elevado potencial antioxidante desse extrato. Além disso, esse extrato foi capaz de inibir a enzima alfa−glicosidase (CI50 = 22,2 ± 1,2 ug mL−1) com resposta superior ao padrão acarbose (CI50 = 62,2 ± 1,2 ug mL−1). O mecanismo de ação foi confirmado por meio do experimento in vivo com animais saudáveis hiperglicêmicos (Mus musculus Swiss), o qual evidenciou um declínio na curva da glicose 30 min após a dose oral de maltose em duas concentrações testadas (100 mg/kg pc e 200 mg/kg pc). O presente estudo corrobora com o uso popular dessa espécie para o tratamento do diabetes, bem como comprova a via de ação hipoglicemiante e antiglicante, bem como alicerça futuros estudos químicos e farmacológicos dessa espécie.