Introdução: O controle da qualidade em laboratórios de ensaios tem como objetivo a garantia da qualidade dos resultados. A NBR ISO/IEC 17025:2017 é o sistema da qualidade mais utilizado em laboratórios e descreve os requisitos para produzir resultados precisos e confiáveis. Um desses requisitos é a utilização materiais de referência (MR) como controle interno das análises. As bactérias de referência são obtidas de provedores internacionais, porém o alto custo para aquisição e os requisitos para a importação de materiais biológicos dificultam a obtenção pelos laboratórios brasileiros. Portanto, destaca-se a importância do desenvolvimento de bactérias de referência nacionais, isoladas de alimentos, para serem utilizadas como controle interno em análises de alimentos. Objetivo: Desenvolver MR de Staphylococcus aureus para uso em análises quantitativas seguindo os critérios da NBR ISO GUIA 34. Metodologia: Foram selecionadas 10 cepas de S. aureus isoladas de alimentos pelo Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia do INCQS/Fiocruz. Foi realizada a identificação fenotípica (Vitek 2.0) e genotípica (sequenciamento do gene 16S rRNA). A autenticidade dos microrganismos foi realizada pela técnica ERIC-PCR. A escolha da cepa candidata a bactéria de referência (CBR) foi realizada pela análise filogenética dos isolados e das cepas ATCC utilizadas. A partir da cepa escolhida, foi produzido um lote de CBR e realizados os testes de pureza, homogeneidade e estudo da estabilidade nas temperaturas de -20ºC e de -70ºC. A avaliação estatística da homogeneidade foi realizada pelo protocolo harmonizado e do estudo da estabilidade por regressão linear segundo a NBR ISO GUIA 35. Resultados: Os 10 isolados foram identificados fenotipicamente como S. aureus. Na análise do gene 16S, as sequências obtidas foram comparadas com as do GenBank e confirmaram a autenticidade dos microrganismos. No dendograma construído a partir da ERIC-PCR foi observado que a cepa 44, isolada de hambúrguer bovino, possuía 87,5% de similaridade com a cepa ATCC 6538P, sendo selecionada para a produção do CBR. O lote produzido foi considerado puro, suficientemente homogêneo e estável durante nove meses nas temperaturas estudadas. Conclusão: O lote se mostrou adequado para utilização como MR para controle interno no ensaio de contagem de Estafilococos coagulase positiva em alimentos.