Antimicrobianos da família dos macrolídeos, entre essas a tilosina, são amplamente empregadas na avicultura. Os resíduos dos fármacos na cama de frango expostas ao ambiente podem impactar o mesmo. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver e validar método para a determinação de tilosina em cama de frango empregando a cromatografia líquida de ultra alta eficiência associada a espectrometria de massas sequencial (UHPLC-MS/MS). Para a extração sólido-líquido foram avaliados diferentes solventes. A mistura acetonitrila:água 1:1 (v/v) levou a uma eficiência de extração de tilosina de 55% e um efeito matriz em torno de -30%. Como padrão interno foi selecionado a roxitromicina. O método desenvolvido foi validado, e foram estabelecidos os seguintes parâmetros: faixa linear de 5 a 100 µg/g, com linearidade (r) > 0,98, precisão intra-dia de 6,0% e exatidão de 103 a 111%.