miR-210 INHIBITION IN ASSOCIATION WITH IONIZING RADIATION REDUCES CELL VIABILITY IN GLIOBLASTOMA CELL LINE WITH WILD-TYPE TP53

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  • Presentation type: PD - PostDoctoral
  • Track: 3. Molecular Biology
  • Keywords: Glioma; microRNA-210; Radioresistance; liquid biopsies;

Authors:

  • 1 Instituto Nacional de Câncer
  • 2 Universidade Federal do Rio de Janeiro
  • 3 INCA

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Diffuse astrocytic tumors are the most frequent malignant brain tumors. Among them, glioblastoma (GBM) is the most aggressive and invasive subtype. Surgery followed by radio- and chemotherapy is the first line treatment, however the overall survival is dismal with a five-year survival rate of only 9%. Treatment resistance and tumor progression are responsible for therapy failure. Recently, our group demonstrated that p53 expression by immunohistochemistry, a surrogate marker of mutation, contributes for astrocytic tumors diagnosis and is associated with better response to radiotherapy. Furthermore, cell line-based assays corroborated these findings. In this context, miR-210 is associated with tumor progression and radiotherapy resistance. Therefore, the aim of this study is to understand miR-210 role in response to treatment with ionizing radiation in cell lines with different p53 mutational status and its impact in diffuse astrocytic tumors’ diagnosis by liquid biopsies.
MATERIALS AND METHODS: U251-MG (TP53 mutated) and A172 [TP53 wild-type (WT)] GBM cell lines were exposed to ionizing radiation to mimic response to radiotherapy. Inhibition and overexpression of miR-210 were performed by transient transfection with antagomiRs and miRNA mimics, respectively. Protein levels were assessed by Western blotting and gene expression by RT-qPCR. Citotoxicity was evaluated by trypan blue exclusion assay; annexin V/PI and DNA fragmentation by cytometry. Cell proliferation by violet crystal and clonogenic assays. Blood-derived samples was obtained from patients registered at Neurosurgery department from INCA. This study was approved by the institutional ethics committee. RNA was obtained from patients’ plasma samples using Plasma miRNeasy Kit and miRNA expression assessed by RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSIONS: U251-MG (TP53 mutated) express six times higher levels of miR-210 than A172 (TP53 WT) cells. Overexpression of miR-210 in A172 did not change cells susceptibility to ionizing radiation. However, inhibition of miR-210 reduced cell viability and proliferation by trypan blue exclusion and clonogenic assays, respectively. On the other hand, miR-210 modulation did not change U251 (TP53 mutated) cells response to ionizing radiation, suggesting that the effect is dependent on functional p53. Additionally, fourteen peripheral blood samples were obtained from patients with diffuse astrocytic tumors. GBM patients’ plasma samples had higher miR-210 levels in comparison to lower diffuse astrocytic tumors’ grades. Our results demonstrate that although miR-210 was not responsible for radioresistance in GBM cell lines, its inhibition reduced cell proliferation in response to ionizing radiation in A172 cells. In addition, miR-210 expression was higher in GBM patients’ samples, pointing out miR-210 as promising minimally invasive biomarker accessible by liquid biopsies.

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Paula Sabbo Bernardo

Obrigada! O miR-210 tem sido relacionado com os eventos de angiogenese e TEM. Com relação à angiogenese, ele tem sido relacionado principalmente por ser um miRNA induzido por hipóxia. Um dos principais fatores de transcrição desse miRNA é HIF-1alfa e em resposta à essa sinalização o miR-210 pode promover angiogenese em alguns tipos tumorais. Com relação à TEM, já foi demonstrado que ele pode regular a expressão de Snail e Slug, além de N-caderina, contribuindo para o fenótipo de TEM. No contexto dos gliomas, já foi descrito um processo TEM-like, mas não foi demonstrada participação desse miRNA até o momento. O miR-210 tem um papel dual e em alguns modelos como câncer de esôfago, ele tem sido descrito como supressor tumoral e, em outros modelos, como oncogenico. Com relação aos gliomas, ainda existe bastante controvérsia na literatura, mas pelo nossos resultados acreditamos que o status mutacional de p53 possa influenciar esse papel dual do miR-210. 

Author

Paula Sabbo Bernardo

Obrigada, Profa. Jamila. 

O nosso grupo avaliou em um artigo publicado em 2018 amostras incluídas em parafina de 133 pacientes com astrocitomas difusos. Nesses casos, avaliamos os níveis proteicos de p53 e survivina (proteína antiapoptótica da família das IAPs) e observamos que essas proteínas contribuíam tanto para o diagnóstico diferencial desses tumores como para o prognóstico quando levamos em consideração o tratamento com radioterapia. Ou seja, os casos com altos níveis de p53 ou altos níveis de survivina tratados com radioterapia apresentaram maior sobrevida em relação aos casos com baixos níveis proteicos. Além disso, os casos com baixos níveis proteicos apresentaram a mesma sobrevida com ou sem tratamento com radioterapia. Esse dado nos chamou a atenção, principalmente pelo fato de altos níveis proteicos de p53 estar associado à presença de mutação, sugerindo que pacientes com mutação se beneficiam do tratamento com radioterapia. Então, respondendo a primeira pergunta, no nosso estudo avaliamos apenas p53 e survivina isoladamente. Devido ao pequeno N ao estratificarmos, não foi possível avaliar ambas as proteínas simultaneamente. 

Existem outros estudos na literatura que associam a expressão e mutação em proteínas de reparo com a resposta ao tratamento com radioterapia, mas não avaliamos nenhum alvo em nosso estudo. Nosso grupo também já demonstrou que existe diferença na expressão das bombas de efluxo PgP e MRP entre os diferentes astrocitomas difusos, mas não avaliamos resposta ao tratamento nesse estudo de 2008. 

Author

Paula Sabbo Bernardo

Com relação às demais perguntas, na análise do miR-210 no plasma dos pacientes, avaliamos 14 casos até o momento, mas estamos aumentando o N para conseguirmos realizarmos análises mais robustas e relevantes. Além disso, pretendemos comparar os níveis de expressão nas amostras tumorais e sequenciar essas amostras para avaliar a presença de mutação em TP53. Dessa forma, poderemos avaliar se realmente existe correlação entre esses fatores nas amostras de pacientes.

Quanto aos ensaios in vitro, como nós observamos também uma maior sensibilidade à radioterapia das linhagens com mutação em TP53, pretendemos inserir uma mutação na linhagem selvagem e avaliar se existe mudança no perfil de sensibilidade ao tratamento. E com relação ao miR-210, nós já observamos que ele não é responsável pelo diferente perfil de morte celular, mas parece estar envolvido na proliferação celular. Então, realizaremos avaliação da proliferação usando CFSE por citometria de fluxo. Além de alvos desse miRNa que estão relacionados à proliferação e ciclo celular após superexpressão e inibição como E2F3 e MNT ( inibidor de c-MYC).

Esses resultados poderiam apontar o miR-210 com um potencial alvo para tratamentos adjuvantes à radioterapia. Além disso, se os resultados com as amostras de pacientes confirmarem o miR-210 como um fator relevante para o diagnóstico e prognóstico desses tumores de maneira minimamente invasiva, isso seria muito importante, pois permitiria acompanhar esses pacientes através de exames de sangue de rotina, além dos exames por imagem. 

Desculpe a resposta longa e me coloco à disposição para demais esclarecimentos. 

Mas uma vez, obrigada pelas perguntas e interação. 

Author

Paula Sabbo Bernardo

Correção: "mais uma vez"