Boa tarde, Isabella! Muito obrigada pelo elogio e por suas questões. Vou respondê-las abaixo, e se qualquer dúvida permanecer, por favor me contate!

1.a.  O ensaio de viabilidade celular (MTT) foi realizado para fazermos um screening inicial de como essas células se comportam frente a diferentes concentrações dos contraceptivos, já que precisaríamos adaptar a dose da formulação, que é uma alta dose hormonal por ser injetável mensal e ficar armazenada no músculo, sendo liberada aos poucos na circulação da mulher. Então nesse primeiro ensaio escolhemos concentrações mais altas e mais baixas para entendermos quais concentrações seriam tão altas a ponto de matar as células e quais seriam tão baixas a ponto de não ter efeito algum, para adptarmos ao estudo in vitro e prosseguirmos com os outros ensaios. A partir desse resultado, descartamos as concentrações mais altas, que realmente em um dos contraceptivos teve um possível efeito citótoxico, e fizemos maiores diluições para chegarmos às concentrações relatadas como as séricas e até abaixo delas, performando então o ensaio de acúmulo celular. Esse segundo ensaio, portanto, foi realizado com as concentrações mais abrangentes pois já havíamos feito esse screening inicial, e queríamos ter um ensaio que chegasse às concentrações séricas, chegando mais perto do quanto essas células são expostas a esses hormônios, e assim entendermos os mecanismos envolvidos nessa interação. Inclusive, sim, era nosso objetivo chegar às doses séricas.  

1.b. Talvez eu não tenha me feito muito clara sobre estudos anteriores utilizarem altas concentrações. Eu estava me referindo na verdado ao fato de os contraceptivos presentes no mercado terem, alguns anos atrás, doses hormonais mais altas, portanto os estudos epidemiológicos abrangiam mulheres que utilizavam outras concentrações hormonais. E estudos in vitro relacionados à mama utilizam muitas vezes linhagens já tumorais, mas abrangem também diversas concentrações dos hormônios, utilizando altas e baixas doses nesses tipos celulares. 

2. O ensaio de acúmulo celular foi realizado em placas de 96 poços. Plaqueamos um número fixo de células no primeiro dia, em 5 placas diferentes. No dia seguinte, fixávamos uma das placas em etanol, ainda sem contraceptivos, e nas outras 4 plaqueávamos, em triplicata, as diferentes concentrações e formulações, conforme mostro na tabela. A cada 24h, fixávamos uma das placas, até o tempo de 96h. Após, fazíamos a leitura por coloração de cristal violeta em espectrofotômetro. Com isso, tínhamos, a cada dia, o quanto de células estavam acumuladas em cada concentração e tempo. Inclusive, muitas vezes esse ensaio é denominado de proliferação celular, porém o que medimos ao final não nos diz se houve proliferação ou inibição de morte, somente se as células acumularam mais ou menos em relação ao controle. Para vermos modfiicação na prolideração, faremos o ensaio de ciclo celular por citometria. 

3. Os ensaios de nosso trabalho são focamos em entendermos os possíveis mecanismos de interação entre as formulações dos contraceptivos e as células de mama, nos dando base para, futuramente, aplicarmos in vivo e assim complementarmos tais resultados, associando à interação no tecido mamário. E sim, pensamos em estudarmos mais sobre os receptores e as vias posteriormente. Agradeço inclusive a pergunta por acabar até sendo uma sugestão caso não tivéssemos pensado. Se você trabalhar com isso, seria ótimo saber mais sobre sua opnião e ideias!! 

4. Concordo com esse tipo de estudo ter limitações, e temos tido sim alguns desafios. Um deles é que por serem linhagens celulares, não podemos avaliar o efeito dessa exposição na mama a longo prazo. Além disso, utilizamos formulações que são injetáveis, mas no modelo celular não mimetizamos as diferenças de via de administração no efeito desses contraceptivos. Acreditamos, porém, que avaliar esses possíveis mecanismos de interação in vitro certamente será de valia para o debate acerca dessa controvérsia por mostrar, na interação direta entre contraceptivo e célula mamária, que tipo de mecanismo pode ser alterado - ou não, explicando o que pode ser visto in vivo. 

5. As diferenças mais importantes dos dois contraceptivos utilizados são os tipos de veículo e as formulações em si. A NE+VE é uma solução oleosa, e a MA+EC é aquosa, o que poderia - e realmente gerou - diferença nas respostas celulares. Sobre a NE+VE, em que as maiores concentrações geraram diminuição da viabilidade celular, nossa hipótese é que seja um efeito lipotóxico pela alta concentração lipídica na solução, não necessariamente um efeito do contraceptivo em si. 

Espero ter respondido suas dúvidas. Mais uma vez, agradeço muito por você ter assistido meu trabalho e se interessado a ponto de ter questionamentos - e ótimos questionamentos! Se algo ainda não ficou claro, me contate que tentarei explicar mais. 

Muito obrigada, Isabella! Suas questões foram extremamente relevantes!