To cite this paper use one of the standards below:
Please log in to watch the video
Log inINTRODUCTION AND OBJECTIVES: Macrophages are extremely plastic myeloid cells responsive to stimuli from the microenvironment that can modulate their phenotype and function. These macrophages are main leukocytic infiltrates in tumors where are also known as TAM (tumor-associated macrophages) or M2-like, which plays an important role in tumor progression promoted by the crosstalk of these cells. Macrophage activation is widely described as M1 or M2 polarization. The M1 profile can be activated by IFN-γ, LPS or both and the M2 profile can be activated by IL-4/IL-13, immune complexes, or glucocorticoids. The PI3K pathway is described as one of the most important mechanisms for regulating cell metabolism and proliferation, and some research suggests that this pathway plays a central role in regulating the macrophage activation phenotype. Clotrimazole (CTZ) is an imidazole derivative with antiproliferative activity mainly because it is involved in the inhibition of glycolytic enzymes and our group have shown that CTZ inhibits PI3K activation by inhibiting its catalytic site. The main objective of this work is to evaluate the inhibitory effect of PI3K by CTZ on macrophages polarization. MATERIAL AND METHODS: Raw 264.7 and J774 macrophages were seeded in six-well plates (5x105 cells/well), after attachment the cells were treated with 20ng/mL of IL-4 for polarization to M2. After 24h, the media was removed and a fresh medium with CTZ (10µM) or with LY294002 (0.1µM) was added for 24h treatment. After 24h, the cells were stimulated with insulin (100nM) for 30 minutes. Cells were lysed and proteins were extracted for Western Blotting. RESULTS AND CONCLUSION: Our data show that CTZ inhibits PI3K pathway activation observed by decreasing phosphorylation of downstream effectors of this pathway. Furthermore, differences in the expression of M1 and M2 markers such as iNOS and arginase, respectively, are observed. The present work supports the inhibition of PI3K by CTZ and, in parallel, the role of PI3K in the macrophage polarization process.
Gustavo Henrique Cardoso Guimarães
Boa Tarde, José Xavier.
Me chamo Gustavo Guimarães e hoje terei o prazer de avaliar o seu estudo. Em um primeiro momento, gostaria de parabenizá-lo pelo belíssimo trabalho. Espero que ao final de nossa interação minha contribuição seja valorosa para a condução do seu projeto.
Farei as perguntas por ordem, mas fique à vontade para respondê-las da forma que achar pertinente.
1 – Gostaria que você explicasse melhor o seu desenho experimental. Qual a importância da utilização da insulina no seu experimento? O tratamento com IL-4 entrou no resultado de WB que você demonstrou ou é uma perspectiva futura (não ficou muito claro na figura)?
2 – Vocês pretendem (ou já foi realizado?) induzir a ativação dos macrófagos para o perfil M2 por outras formas, como por IL-13, complexos imunes ou glicocorticoides, e após essa ativação realizar o tratamento com CTZ, a fim de avaliar uma mudança na polarização dos macrófagos?
3 – Os experimentos de WB relativos a inibição da via de PI3K/AKT foram realizados por você? Quantas vezes esse experimento foi realizado? Foi comentado na apresentação que houve redução na fosforilação da AKT no resíduo de treonina, no entanto não é possível observar tal redução nas figuras e gráficos apresentados, vocês possuem algum resultado complementar demonstrando essa redução?
4 – Você saberia dizer o motivo do LY ter aumentado a expressão da fosforilação da proteína S6?
5 – De acordo com os trabalhos apresentados no slide de bibliografia, avalio que algumas perguntas já foram respondidas, como o fato de o CTZ inibir a PI3-K e induzir a polarização dos macrófagos para o perfil M1. Gostaria que você comentasse qual a lacuna do trabalho, ou seja, o que exatamente vocês pretendem responder que ainda não foi investigado?
6 – Quais seriam suas perspectivas? Quais os experimentos serão realizados para dar andamento a esse trabalho?
Thayana Barbosa
Parabéns pelo trabalho! Apresentação muito clara!
Você comenta que alguns estudos sugerem o efeito do Clotrinazol em câncer, incluindo o estudo recente do seu grupo utilizando melanoma como modelo. Fiquei curiosa para saber o efeito desse medicamento em outros tipos de câncer. Poderia comentar um pouco? Existe alguma observação sobre toxicidade?
José Xavier do Nascimento Júnior
Olá, Thayana! Muito obrigado pelo elogio! Nosso grupo já avaliou também os efeitos do clotrimazol em tumores de mama (Furtado et al, 2012; Marcondes et al, 2015; Furtado et al, 2015). Em relação à toxicidade acredito que não há nenhuma observação embora comercialmente o clotrimazol seja vendido somente em formulações de uso tópico e intra-vaginal (com ação antifúngica).
Thayana Barbosa
Obrigada! Desejo sucesso com o trabalho!
José Xavier do Nascimento Júnior
Muito obrigado!!
With nearly 200,000 papers published, Galoá empowers scholars to share and discover cutting-edge research through our streamlined and accessible academic publishing platform.
Learn more about our products:
This proceedings is identified by a DOI , for use in citations or bibliographic references. Attention: this is not a DOI for the paper and as such cannot be used in Lattes to identify a particular work.
Check the link "How to cite" in the paper's page, to see how to properly cite the paper
José Xavier do Nascimento Júnior
Boa tarde, Gustavo! Muito obrigado pelo elogio! Irei responder em ordem para que fique mais fácil de associar as respostas às perguntas. 1 - Sobre o nosso desenho experimental: Utilizamos duas linhagens de macrófagos (Raw 264.7 e J774), tratamos 24h com clotrimazol ou LY e posteriormente estimulamos com insulina. A importância da utilização da insulina se dá pelo fato dessa via ser ativada majoritariamente por insulina o que facilitaria as análises referentes ao funcionamento dos inibidores utilizados e os impactos da inibição dessa via. Em relação ao IL-4 a intenção é exatamente induzir a polarização M2 e avaliar o efeito do CTZ sobre essa polarização. Já temos alguns resultados referentes a essa polarização M2 seguida de tratamento com CTZ, embora não tenha sido mostrados aqui justamente por querermos apresenta-los de forma mais robusta. 2 - Outra forma que temos utilizado para polarizar em M2 é utilizando lactato conforme demonstrado em um trabalho do nosso grupo (OCHIONI et al, 2021). 3 - Sim, todos os resultados de WB foram realizados por mim. Estou repetindo todos os experimentos para que possamos justamente ter relevância estatística. A redução é possível observar quando comparamos a fosforilação no controle estimulado com insulina e clotrimazol estimulado com insulina. 4 – Ainda não saberia dizer o motivo do aumento da fosforilação de S6 quando tratamos com LY, mas é um dos nossos objetivos avaliar essa questão. 5 – Nosso objetivo, além de tornar todos os nossos dados mais robustos, é avaliar todo o mecanismo da ação do clotrimazol sobre a polarização dos macrófagos, descrevendo e analisando todas as vias que possam estar envolvidas. Todos os dados na literatura mostram o papel importante da PI3K nessa ativação macrofágica, mas como essa cascata de sinalização ocorre ainda é bastante discutida. 6 – Nossas perspectivas é continuar avaliando todas essas vias testando também os efeitos do clotrimazol quando polarizamos esses macrófagos em M1 (LPS e/ou IFNgama) e M2 (IL-4 e lactato) por WB e PCR. Além disso, é um dos nossos objetivos avaliar também usando BMDM. Att, José.
Gustavo Henrique Cardoso Guimarães
José,
Muito obrigado pelas respostas. Seu feedback demonstra que você possui um grande domínio e entendimento do seu trabalho. Fiquei bastante satisfeito, principalmente no que diz respeito ao objetivo do estudo.
Desejo que o projeto dê muitos frutos.
Abraços,
Gustavo.
José Xavier do Nascimento Júnior
Fico bastante feliz! Muito obrigado! Abraços, José.