Boa tarde, Eduardo!  1 - A mutação R280K da p53 ocorre no domínio de ligação ao DNA da proteína em linhagem de câncer de mama triplo negativo, que é um tumor bastante agressivo. Não é um hot spot, mas dentro do câncer de mama, a linhagem MDA-MB-231 é um modelo bastante utilizado, no qual já foi caracterizada a formação de agregados. Além disso, vale mencionar que utilizamos o mesmo mutante (R280K) nos experimentos in vitro e em células. 2 - Acerca da toxicidade desses oligômeros e o efeito da agregação de p53 nessas células, ainda estamos investigando... Precisamos de mais experimentos acerca da natureza e tamanho desses agregados para entendermos as principais diferenças entre eles. O que sabemos é que, in vitro, como apresentado, o perfil cinético de agregação da proteína e a formação desses oligômeros é diferente na presença de heparina, podendo esse efeito ter sim uma relação, direta ou indireta, com a malignidade dos tumores. Além disso, alguns estudos sugerem um efeito positivo do uso da heparina em pacientes com câncer, descrevendo que a utilização de heparina é capaz de inibir a proliferação e a angiogênese em modelos de tumores pancreáticos. 3 - Na verdade, as concentrações escolhidas foram, propositalmente, para cobrir uma faixa grande em que pudéssemos selecionar uma concentração que não fosse tão tóxica para as células, mas não tem a relação com a concentração profilática. 4 - Bom, primeiramente, temos dois ensaios que possuem objetivos distintos: enquanto o MTT analisa viabilidade celular, focando na atividade mitocondrial da célula, o LDH é um parâmetro para células mortas que perderam a integridade da membrana e são detectadas através da liberação da enzima lactato dehidrogenase no meio de cultura. Sendo assim, a atividade mitocondrial não necessariamente está relacionada à morte celular, o que pode traduzir essa discrepância observada. No que se refere a essa possível sensibilidade da H1299 ao efeito de adição de heparina, como se trata de uma linhagem que não expressa p53, com mais experimentos poderíamos investigar a possibilidade de se tratar de um efeito protetor de p53, tendo em vista que o efeito de "morte" é menos observado em células que expressam p53. No entanto, esses são dados preliminares que serão repetidos levando em consideração o fator de confluência como controle também. 5 - Não conhecia esse estudo, apesar de já ter visto trabalhos acerca de doenças amiloidogênicas distintas, com mecanismos semelhantes que tratam da relação entre GAGs e agregados amiloides e as consequências dessa interação para o desenvolvimento dessas doenças. Vou me informar acerca desse estudo que você mencionou...

Espero ter conseguido sanar todas as suas dúvidas...Agradeço o interesse pelo meu trabalho e os elogios!

Oi, Anneliese! Bom dia! Com essa análise inicial do efeito do tratamento das células com heparina, empregamos uma faixa de concentração mais abrangente para que pudéssemos selecionar uma concentração que não fosse demasiadamente tóxica para as células e, assim, utilizaríamos nos próximos experimentos. Os dados dos ensaios de LDH e MTT nos surpreenderam sim, já que esperávamos que o efeito a ser observado fosse fortemente dependente da concentração de heparina. No entanto, apesar de serem dados preliminares em que se torna necessária a repetição e investigação desses efeitos, dados os objetivos de cada um dos ensaios, em que em um avaliamos potencial redutor intracelular (não necessariamente possuindo relação com a morte) e no outro, avaliamos um parâmetro de morte celular, existe uma relação entre a expressão de p53 e a viabilidade celular, tendo em vista que a linhagem que não expressa p53 aparenta ser mais sensível ao tratamento com heparina. Dessa forma, penso ser coerente que investiguemos a possibilidade de se tratar de um efeito protetor, tendo em vista que a morte celular é, aparentemente, menor em células que expressam p53. Sendo assim, considerando também os dados dos experimentos in vitro, pretendemos avaliar o efeito da agregação de p53 nessas células através de experimentos de Western Blotting, por exemplo. Agradeço a sugestão... é bastante coerente. Obrigada!