Olá Raíssa,

Parabéns pelo trabalho. Muito interessante.

Considerando as características do ensaio de MTT, recomendo a leitura de uma mini-revisão feita pela Promega sobre seu mecanismo e limitações (https://www.promega.com.br/resources/pubhub/is-your-mtt-assay-really-the-best-choice/). Acredito que ela possa trazer nova luz sobre as interpretações dos resultados apresentados, pois eles podem estar mais associados ao metabolismo geral celular do que efeitos celulares de proliferação e morte.

A curva-dose resposta para cálculo do IC50 também foi feita pelo ensaio de MTT, certo?

Vocês pretendem confirmar estes resultados com uma segunda metodologia?

Obrigado

Parabéns pelo trabalho. Excelente apresentação.

Qual a linhagem de camundongo utilizada? Foram utilizados tanto machos quanto fêmeas? De que idades?

Qual o tempo médio para aparecimentos das metástases?

Qual o critério de tempo para o animal ser classificado como parte do grupo "ausência de metástase"?

Existe alguma investigação estatística entre a associação de critérios clínicos dos pacientes (sexo, idade, tamanho do tumor, comprometimento de linfonodos regionais, grau tumoral, classificação molecular, comorbidades, tratamento prévio, etc...) com o sucesso do modelo?

Existe alguma investigação estatística entre a associação de características de sexo, idade, peso, perfil imunológico, perfil de citocinas dos camundongos com o sucesso do modelo?

Qual a quantidade de células injetadas? Qual a via do inoculação das células de pacientes? Qual o veículo das células (meio de cultura, salina, etc)?

Qual o critério de corte dos órgãos? Número de cortes consecutivos ou espaçados avaliados para cada órgão? Qual a espessura dos cortes? É possível estimar o volume de cada órgão que foi cortado e investigado?

Avaliação dos HEs foi feita por patologista com experiência em pequenos animais? Houve treinamento específico dos alunos para esta a avaliação histopatológica e identificação das células de metástase de melanoma? 

Quantas pessoas avaliaram cada corte? 

Oi Raíssa! Parabéns pela apresentação! Gostaria de te perguntar se os derivados de vitamina K não exerceram nenhum efeito sobre a linhagem TP53 mutante. No tratamento de 48 hs, a impressão é de que algumas drogas aumentaram a viabilidade na MDA-MB-231. Obrigada!

Bom dia Leonel!

Parabéns pela excelente apresntação! Você poderia me explicar melhor como será realizado os próximos passos? As linhagens de GBM serão cultivadas na presença do sobrenadante da cultura célular primária dos diferentes fenótipos de astrócitos? A invasão será avaliada através de qual ensaio? Transwell?

Boa tarde Jose Marcos, parabéns pelo trabalho! Qual foi a plataforma utilizada para os dados de expressão de PFKFB3 nas células do microambiente in silico?

Qual foi o N da análise de sobrevida do GBM?

Qual a importância da alta expressão da PFKFB3 no microambiente tumoral? Qual a relevância no contexto dos GBMs?

O que mais vocês pretendem fazer para investigar o papel de PFKFB3 no GBM?

Primeiramente gostaria de parabeniza-lo pela sua apresentação e pelos seus resultados. O projeto tem um fundamento em pesquisa básica e um potencial desdobramento em pesquisa translacional, confirmando-se a hipótese do papel do inibidor da PFKFB3 e dos demais ensaios futuros.

Visto que você analisou dados depositados em bancos publicos de dados, além da sobrevida, existe alguma associação entre a expressão de PFKFB3 e as características clinico-patológicas dos pacientes?

Sobre a análise de sobrevida, você encontra uma associação significativa entre a expressão desse gene e o prognóstico dos pacientes com glioma. Em glioblastoma a análise não apontou um resultado significativo. Entretanto, nenhuma análise de ajuste ou modelo de regressão foi apresentada, indicando que as análises de sobrevida são análises univariadas. Você fez análise multivariada para os dados com glioma? E com os dados de glioblastoma, houve alguma tentativa de ajustar o modelo, incluindo idade, sexo, estadiamento?

A informação sobre o papel do infiltrado inflamatório expressando PFKFB3 indica uma possível interação dessa proteína produzida pelas células imunes com as células tumorais. Entretanto, suas análises com linhagens tumorais usou um bloqueador para a proteína produzida na célula tumoral. Assim, de que forma esse resultado com dados do infiltrado inflamatório será utilizado na sua pesquisa? Qual é o possível desdobramento dessa observação nos ensaios in vitro?

O impacto de PFK15 inibindo PFKFB3 na reprogramação transcricional já foi avaliado em glioblastoma ou em algum outro tumor? Uma vez que essa inibição consegue modular a viabilidade celular, morte celular (incluindo apoptose) e proliferação, não surge a curiosidade de saber quais genes são superexpressos ou subexpressos após inibição de PFKFB3?

No aguardo,

Pedro

Boa tarde, Renato. Primeiramente, parabéns pelo seu trabalho. Gostei bastante do seu vídeo.

Os resultados obtidos no TIMER foram muito interessantes. No entanto, sabemos que o GBM possui 4 subtipos moleculares: proneural, neural, classical e mesenchymal, inclusive é mencionado no resumo quando diz que “It is important to say that these results are related to the GBM in general, thus, these observed correlations can be stronger or weaker depending on the molecular profile of the GBM presented.” Dessa forma, gostaria de saber se o grupo pretende reanalisar os experimentos in sílico considerando os subtipos individualmente.

Boa tarde Renato. Parabéns pelo trabalho! A expressão deste receptor (a7nAChR) está aumentada nos GBMs em relação a outros tipos de tumores do sistema nervoso central? Ou mesmo em relação aos tecidos não tumorais do sistema nervoso central?

Quais experimentos adicionais (in vitro) vocês pretendem realizar para avaliar o papel dos receptores a7nAChR?

Em relação aos dados in silico, vocês pretendem validar essas correlações entre o a7 e as proteínas analisadas? Como?

Bom dia, Juliana. Primeiramente, parabéns pelo seu trabalho. Gostei bastante do vídeo.

Farei algumas perguntas que farão parte do processo de avaliação, mas acredito que elas também contribuirão para a futura publicação:

1) No resumo é mencionado que “A list of four target proteins (patent pending) was proposed from this inference for 111 breast tumor patients that included the different molecular subtypes (…). Mas não ficou claro para o que esta lista se propõe.

Também é mencionado que “The overexpression of these four proteins was validated remaining high in all molecular subtypes.” Novamente, não ficou claro para o que a expressão dessas proteínas se propõem.

Seriam marcadores de pior prognostico? Foi realizada uma curva de sobrevida global ou livre de doença para suportar a relevância desses alvos no desfecho clínico das pacientes?

2) Pelo que entendi através dos resultados, essas proteínas são expressas em alto niveis em amostras ou células de câncer de mama quando comparadas ao tecido nao tumoral. No entanto, gostaria de saber qual se a expressão delas é exclusiva a neoplasias de mama ou se também ocorre em outras patologias da mama como Fibroadenoma, Displasia mamária, etc.

3) Na figura mostrada na apresentação com o titulo “Gene expression profile of the selected targets in tumor and non-tumor tissues”, eh apresentado que o gente B possui uma  mediana de expressão em tumores de cabeça e pescoço superior as amostras de câncer de mama; e que o gene D uma mediana de expressão em tumores de colón e rins também superior as amostras de câncer de mama.

Será que estes dois seriam marcadores de carcinomas em geral e não exclusivos ao câncer de mama?

4) Nas últimas linhas do resumo, eh mencionado que “To understand which intracellular pathways could be involved with these proteins, analysis from the human interactome data was performed. We observed that the proteins downstream the intracellular signaling pathway present important roles in many processes of tumor progression.”

Qual foi a ferramenta utilizada para as análises de interactoma? Quais foram os processos celulares e vias de sinalização encontrados? Qual foi o p-value ou z-score ou false discovery rate usado como corte para essas analises?

5) A última frase do resumo afirma  “we expect that these proteins could be considered as suitable targets for therapy with a lower rate of undesirable side effects and greater therapeutic efficacy.”

Apesar dessa afirmacao, as pesquisas e o tratamento do câncer de mama se concentram atualmente no tratamento personalizado, considerando a história das pacientes e cada subtipo como uma doença diferente. Dessa forma, considerar algo que é comum a todos os subtipos não seria caminhar contra o tratamento personalizado?

Leonel, first of all, congratulations for your results and video. The project is exciting and has a high potential for translational research. Based on your fibronectin and laminin expression results, some questions arose.

TP53-/- astrocytes express the same levels of fibronectin and laminin in the ECM as TP53+/- astrocytes. Thus, the role of TP53 in this context is related to the mutational gain of function or loss of their tumor suppressor function due to lack of p53 expression?

Furthermore, are fibronectin and laminin genes (or gene families) TP53 targets? Has the regulation of these genes by TP53 already been presented in other studies?

What additional experiment do you suggest to confirm your hypothesis regarding the loss of p53 impacting the fibronectin and laminin expression in the astrocytes ECM?

Regards

Pedro

Prezada Julia,

Parabéns pela sua excelente aprestação.

Gostaria que você comentasse a respeito dos seguintes pontos:

1. Os bancos usados para prospecção das proteínas de membrana foram de dados transcriptômicos, sabendo que pode haver uma diferença entre transcrição e tradução, você acha que seria importante pesquisar bancos com dados proteômicos?

2. Você saberia dizer se as proteínas de membrana selecionadas são glicosiladas?

3. Para uso como biomarcador, a combinação das proteínas poderiam trazer uma melhor seletividade e especificidade na ROC?

Obrigado e parabéns.

Fábio

Parabéns Isabelle e grupo pelo trabalho. Vocês pretendem investigar estes receptores em outras linhagens celulares de glioblastoma?

Como os quatro transcritos foram identificados como superexpressos?

Boa tarde, João! Parabéns pelo trabalho! Ele me interessa muito, visto que trabalho com células-tronco e câncer colorretal. Gostaria de lhe fazer duas perguntas: 1) por acaso, vocês tem pretensão de estudar a interação dos tumores com os telócitos, conhecidos por estarem na lâmina própria estimulando o nicho de célula-tronco colônica?; 2) vocês pretendem fazer análises in vitro?

Obrigado desde já pela atenção!

Olá Thaíssa parabéns pelo trabalho, bastante interessante. Tenho curiosidade de saber se vocês fizeram a quantificação das substâncias que foram identificadas nas frações selecionadas e se a substância pyrenephorol comum as duas frações está presente nas mesmas concentrações?

Gostaria de saber se vocês pretendem testar a citotoxicidade e seletividade de todas as substâncias identificadas separadamente?

Gabriella, parabéns pelo trabalho! Além de abordar um tema muito promissor na oncologia eu gostei muito da sua apresentação, foi bem clara e objetiva!

Gostaria de fazer algumas perguntas:

1 – Você utilizou duas linhagens de GBM no seu trabalho e identificou diferenças na quantidade de células marcadas e na viabilidade celular após a exposição ao ZIKV. Na sua opinião, por que encontrou diferença entre as linhagens? Essas linhagens são representativas de tumores de baixo ou alto grau, possuem alguma mutação específica que possa ser associada a essa diferença observada, possuem mais marcadores de CSC, presença de receptores que permitem a entrada do vírus, etc?

2 – Qual linhagem endotelial utilizou no seu trabalho?

3 – Você pretende caracterizar o meio condicionado?

4 – Quais são os próximos passos que você irá desenvolver para caracterizar melhor o papel oncolítico do ZIKV?

5 – Pretende avaliar a associação dos tratamentos convencionais para GBM e ZIKV nos seus modelos experimentais?

6 – Existe alguma limitação para o uso terapêutico do ZIKV nos tumores cerebrais? Na sua opinião, utilizar um vírus que pode ser transmitido com facilidade poderia constituir uma limitação para a implementação dessa estratégia terapêutica?

7 – Existe algum relato na literatura de pacientes com GBM que foram infectados por ZIKV e tiveram algum benefício clínico?

Mateus,

Gostei da sua apresentação, foi bem clara. Parabéns.

Você realizou uma revisão integrativa acerca dos efeitos da Hipóxia no fenótipo de CSC no câncer colorretal. E gostaria de fazer algumas perguntas:

1 – Pretende realizar alguma etapa experimental durante o Mestrado?

2 – Quais marcadores de CSC foram utilizados nos estudos para caracterizar essa subpopulação específica (ex.: CD133, AXL, ...)? E quais foram as principais técnicas realizadas para essa identificação (Citometria, IHC, PCR ...)

3 – Em relação às intervenções terapêuticas levantadas na sua revisão, qual composto, droga ou fármaco, na sua opinião, tem maior chance de ser utilizado no tratamento do CRC? Existem estudos clínicos em andamento?

4 – Quais foram as principais abordagens realizadas nos estudos incluídos na revisão para avaliar a hipóxia? E quais os principais marcadores utilizados (detecção direta de HIF, expressão de genes regulados por hipóxia, ...)? E como a hipóxia foi induzida na maioria dos estudos (Modelos 3D, indução química, câmaras de hipóxia, hipóxia induzida por restrição de perfusão, ...)?

4 – Dentre os estudos incluídos na revisão quantos utilizaram modelos in vitro? Algum estudo utilizou modelos animais e/ou avaliou a relação entre hipóxia e CSC em amostras de tumores CRC?

Boa tarde Alexander,

Parabéns pelo trabalho. Queria lhe perguntar que parametros você utilizou para avaliar as correlacoes obtidas dos dados do TCGA e sua relevancia no contexto biológico.

Existem outras citocinas classicamente associadas as respostas a liberação de NETs além da IL1b?

Qual o n dos experimentos de para análise de CCL2 e CCL5? Fiquei curiosa, pois os seus dados são bem interessantes e sugerem uma forte tendência de aumento.

Um belíssimo trabalho, parabéns à Carolinne e ao grupo!

Li o seu resumo e assisti ao seu vídeo, o desenho do trabalho e os resultados mostrados são muito interessantes! Fiquei curiosa em saber como foi feito o tratamento das vesículas com anexina 5, você poderia me explicar melhor ou me indicar uma referência com maiores detalhes desse tratamento? Como vocês interpretam o papel desse tratamento?

Quais serão as próximas etapas deste trabalho?

Oi Natália parabéns pelo trabalho bastante interessante, gostaria de saber o porque você trabalhou com a concentração de 10-5 M? A concentração de 10-9M você explicou então fiquei curiosa de saber de onde surgiu a outra concentração de trabalho?

Outra curiosidade se você vai fazer os ensaios de migração e invasão celular? E também se pretende estudar o metabolismo do BPA e BPS nestas células para ver se existe diferença entre os metabólitos formados?

Boa tarde, Alexander. Parabéns pelo seu trabalho!

Gostaria de te fazer algumas perguntas...

1- Há quanto tempo você desenvolve este trabalho?

Olá, Carolina!

Parabéns pelo trabalho!!

Quais foram as alterações morfológicas que vocês observaram nas HBMEC cultivadas com meio condicionado da T98G?

As HBMEC foram cultivadas em sistema 2D, certo? Vocês já pensaram em fazer este mesmo ensaio com HBMEC cultivadas em um sistemas 3D, como o Matrigel? Já viu trabalhos com este tipo de modelo?

Estas linhagens de glioblastomas são similares em termos de  "agressividade"? Alguma hipótese sobre o motivo do meio condionado de cada uma delas desencadear respostas diferentes nos parâmetros que vocês avaliaram?

Obrigada!

Olá Gabriela parabéns pelo trabalho, fiquei com uma dúvida a respeito do percentual de infecção do ZV sobre as células U87MG e GBM02. Foram iguais? A que você associa a diferença encontrada sobre a viabilidade das duas linhagens de GBM?

Recentemente o ZV ficou muito famoso por causar microencefalia em recém nascidos, saberia me dizer se os efeitos causados pelo ZV que vocês identificaram sobre as células endoteliais e a mudança de fenótipo das microglias poderiam também acontecer durante o desenvolvimento encefálico destes bebês?

Boa Tarde Mateus,

Parabéns pela apresentação. Gostei bastante do seu estudo.

Gostaria que você comentasse acerca das intervenções terapeuticas (terapias-alvo).

Como vatalanib reduz a atividade das proteínas ABC? Quais foram as proteínas avaliadas? Quais quimioterápicos tradicionais foram utilizados?

Qual a previsão da publicação da sua revisão?

Oi Gabriella vc está online? Viu minhas perguntas?

Boa tarde, Carolinne! Parabéns pelo seu trabalho. Gostaria de te fazer algumas perguntas...

1- No caso da linhagem MCF10 praticamente não se observa expressão de sistenina 1 e CD63. Você acredita que as MCF10-EVs foram de fato purificadas?

Parabéns ao grupo pelo trabalho, e a Thaíssa pela apresentação. Já tive oportunidade de trabalhar com produtos naturais e metabólitos de plantas, e sou um grande fã. Tenho algumas algumas curiosidades que gostaria de acompanhar melhor:

1 - Fiquei com a impressão que havia algumas diferenças entre o resumo e a apresentação. P.ex. a escolha de siglas (CEPCL e DPPCL vs PCDF). Usando o esquema da metodologia, CEPCL é o extrato bruto, e DPPCL e PCDF são sinônimos? As frações 9 e 14 são sub-frações de PCDF? E os resultados de redução de número de células, permeabilização e hemólise foram feitos antes desse trabalho, correto? 

2 - Qual foi a técnica usada na análise de viabilidade dos fibroblastos e da OSSC? Foi o ensaio clonogênico? Não ficou claro pela apresentação. De toda forma, "quem" eram esses fibroblastos? É uma linhagem imortalizada ou são fibroblastos extraídos do animal? Pergunto pois tanto o tipo de ensaio como o estado de proliferação deles podem afetar a interpretação do resultado.

3 - Ainda nesse ensaio (e dependendo da resposta anterior), vocês observaram as células tratadas com cada fração ou registraram fotos das mesmas? Houve diferença no tipo de citotoxicidade entre as  frações estudadas (especialmente a 9 e 14)? Vocês viram morte celular ou interrupção de proliferação? Pergunto pois como cada fração pode conter componentes diferentes, um pode estar levando células à morte ou a parada no ciclo celular.

4 - Parabéns pela inclusão dos possíveis componentes de cada fração, ajuda muito a tentarmos entender qual a contrbuição de cada um para o efeito. O efeito na OSSC parece bem semelhante em todas as frações, mas variar bastante nos fibroblastos. Vocês observaram algum componente comum em todas, ou na maioria das frações? Ou algo presente nas mais citotóxicas (para os fibroblastos) que não estivesse presente nas mais moderadas? Acham possível encontrar "um culpado" pela baixa seletividade de algumas frações?

5 - Uma pergunta juntamente com uma sugestão. Me chamou muito a atenção a presença de uma lignana na fração 14. Esse esqueleto metilenodioxi, dimetoxi, em outros compostos, já foi associado tanto com efeito antineoplásico mas também anti-inflamatório. Vocês consideram que uma parte do efeito (em especial os primeiros resultados) possa ser associado à redução na inflamação no microambiente tumoral? Faz parte dos objetivos do trabalho?

Parabéns a todo o grupo, tenho certeza que será um trabalho bastante recompensador!

Thaissa vc está online? Viu minhas perguntas?

Oi Natália vc está online? Viu minhas perguntas?

Parabéns ao grupo pelo trabalho, e a Thaíssa pela apresentação. Já tive oportunidade de trabalhar com produtos naturais e metabólitos de plantas, e sou um grande fã. Tenho algumas algumas curiosidades que gostaria de acompanhar melhor:

1 - Fiquei com a impressão que havia algumas diferenças entre o resumo e a apresentação. P.ex. a escolha de siglas (CEPCL e DPPCL vs PCDF). Usando o esquema da metodologia, CEPCL é o extrato bruto, e DPPCL e PCDF são sinônimos? As frações 9 e 14 são sub-frações de PCDF? E os resultados de redução de número de células, permeabilização e hemólise foram feitos antes desse trabalho, correto? 

2 - Qual foi a técnica usada na análise de viabilidade dos fibroblastos e da OSSC? Foi o ensaio clonogênico? Não ficou claro pela apresentação. De toda forma, "quem" eram esses fibroblastos? É uma linhagem imortalizada ou são fibroblastos extraídos do animal? Pergunto pois tanto o tipo de ensaio como o estado de proliferação deles podem afetar a interpretação do resultado.

3 - Ainda nesse ensaio (e dependendo da resposta anterior), vocês observaram as células tratadas com cada fração ou registraram fotos das mesmas? Houve diferença no tipo de citotoxicidade entre as  frações estudadas (especialmente a 9 e 14)? Vocês viram morte celular ou interrupção de proliferação? Pergunto pois como cada fração pode conter componentes diferentes, um pode estar levando células à morte ou a parada no ciclo celular.

4 - Parabéns pela inclusão dos possíveis componentes de cada fração, ajuda muito a tentarmos entender qual a contrbuição de cada um para o efeito. O efeito na OSSC parece bem semelhante em todas as frações, mas variar bastante nos fibroblastos. Vocês observaram algum componente comum em todas, ou na maioria das frações? Ou algo presente nas mais citotóxicas (para os fibroblastos) que não estivesse presente nas mais moderadas? Acham possível encontrar "um culpado" pela baixa seletividade de algumas frações?

5 - Uma pergunta juntamente com uma sugestão. Me chamou muito a atenção a presença de uma lignana na fração 14. Esse esqueleto metilenodioxi, dimetoxi, em outros compostos, já foi associado tanto com efeito antineoplásico mas também anti-inflamatório. Vocês consideram que uma parte do efeito (em especial os primeiros resultados) possa ser associado à redução na inflamação no microambiente tumoral? Faz parte dos objetivos do trabalho?

Parabéns a todo o grupo, tenho certeza que será um trabalho bastante recompensador!

1 - como foram selecionadas as doses utilizadas?

2 - Entre o BPA e BPS há diferença na indução in vitro do câncer?

Boa tarde

Bastante interessante a análise das alterações morfológicas após o  tratamento com 5-FU. Parabéns.

Vocês pretendem avaliar outros parâmetros da EMT (como invasão e migração, p.ex.)? 

Quais as perspectivas do trabalho?

Isabella,

A sua apresentação foi bem clara e objetiva. Parabéns.

Tenho algumas dúvidas acerca do seu trabalho:

1 - Qual foi o critério utilizado para a escolha das doses dos contraceptivos nos ensaios de viabilidade celular e acúmulo celular? Por que realizou o ensaio de acúmulo celular com concentrações “mais abrangentes”? Na apresentação você comentou que estudos anteriores utilizavam doses altas dos contraceptivos e nos ensaios de acúmulo celular você menciona que utilizou doses relatadas na literatura como equivalentes às concentrações séricas. Era um objetivo utilizar as doses séricas? Os estudos que utilizaram doses maiores também foram realizados in vitro?

2 - Gostaria também que você explicasse como foi realizado o ensaio de acúmulo celular.

3 - Você comenta que mais dados são necessários para relacionar o uso dos contraceptivos com o risco de câncer de mama. Em relação aos ensaios escolhidos no seu trabalho você acha que eles responderiam essa pergunta? Pensou em avaliar vias celulares relacionadas aos receptores hormonais?

4 - Os ensaios in vitro constituem uma importante ferramenta de estudo, mas possuem diversas limitações. Qual o maior desafio, na sua opinião, em usar esse modelo para estudar o impacto dos contraceptivos nas células mamárias?

5 – Em relação aos contraceptivos utilizados, você esperava encontrar diferenças nas viabilidades em relação ao tratamento com NE+EV e MA+EC? No tratamento com NE+EV você encontrou diferenças e no MA+EC não... existe algum dado na literatura que ajude a explicar?

Novamente, parabéns pela apresentação!

Boa tarde! Lindo trabalho! Gostaria de saber se existem estudos com a linhagem HT-29 e se já foram avaliadas mudanças morfológicas com exposição aguda ao 5-FU.