POTENTIAL ROLE OF AKT-FOXK2 REGULATORY AXIS IN BREAST CANCER DRUG RESISTANCE

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Details
  • Presentation type: Mestrado
  • Track:
  • Keywords: Breast cancer drug resistance; FOXK2 transcription factor; AKT oncogenic kinase;
  • 1 INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (INCA)
  • 2 Faculty of Biology, Medicine and Health / The University of Manchester
  • 3 Department of Surgery and Cancer / Hammersmith Hospital Campus / Imperial College London
  • 4 Instituto Nacional de Câncer
  • 5 Programa de Hemato-Oncologia / INSTITUTO NACIONAL DE CANCER / Instituto Nacional de Câncer

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Breast cancer is the leading cause of cancer deaths among women in the world. Recently, our group has demonstrated that FOXK2 transcription factor mediates drug sensitivity in breast cancer cells through transcriptional activation of FOXO3a. Conversely, drug-resistant cells and poor outcome patients show constitutively high protein levels of FOXK2, suggesting that post-translational modifications might be inactivating FOXK2 functions, contributing to drug resistance. An in silico analyses revealed the oncogenic kinase AKT (isoform 1) as the main possible regulator of FOXK2. Thus, our objective is to investigate the role of AKT phosphorylation in the regulation of FOXK2 expression and evaluate the impact of AKT-FOXK2 regulatory axis on doxorubicin resistance in breast cancer. MATERIALS AND METHODS: The MTT and clonogenic assays were performed to assess drug-induced cytotoxicity. For AKT1 knockdown, cells were transfected with non-silencing control (NSC) and AKT1 siRNA using Lipofectamine RNAimax. The LY294002 PI3K inhibitor and the MK2206 AKT inhibitor were used for pharmacological inhibition of AKT phosphorylation. For FOXK2 overexpression, cells were transfected with the empty vector (pCMV5) and the pCMV5-FOXK2 vector using Lipofectamine2000. For inducible constitutively active AKT overexpression, cells were transfected with pBABE-(myr)Akt:ER vector and treated with 200 nM of 4-hydroxytamoxifen. The NE-PER kit was used for cytoplasmic and nuclear extractions. Protein expression in whole and fractioned lysates were examined by Western Blotting. RESULTS AND CONCLUSIONS: Our data indicate that higher protein levels of FOXK2 are associated with increased levels of AKT phosphorylation and with drug resistance in breast cancer cells. Also, FOXK2 and phosphorylated AKT expression was found localized predominantly in the nucleus of drug-resistant MDA-MB-231 cells. Following genetic and MK2206 pharmacological inhibition of AKT, MDA-MB-231 cells showed decreased cell viability, increased sensitivity to doxorubicin treatment and reduced FOXK2 protein levels, particularly of slower mobility bands. Following LY294002 treatment, FOXK2 protein levels were slightly altered and there was no change in FOXK2 subcellular localization, suggesting that AKT activation is not involved in FOXK2 nuclear-cytoplasmic shuttling in our model. Co-transfection experiments revealed that AKT1 inhibition not only decreased endogenous levels, but also exogenous expression of FOXK2. Consistently, overexpression of constitutively active AKT increased FOXK2 protein levels either in MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Altogether, our results suggest that AKT regulates FOXK2 expression in chemoresistant breast cancer cells, providing novel insights into molecular mechanisms of drug resistance. Future experiments involving treatment with lambda phosphatase and co-immunoprecipitation will allow a better understanding of AKT-FOXK2 axis.

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Luciana da Torre Carneiro

Olá, Murilo! Muito obrigada! Vamos lá! Sobre a sua dúvida com relação à figura 2c: Sim, também esperamos uma marcação para Akt total na fração nuclear uma vez que o anticorpo para Akt total detecta ambas as formas de Akt, fosforilada e não fosforilada. A possibilidade para não termos observado uma marcação é ter ocorrido uma compensação na revelação, como proporcionalmente temos uma forte marcação no citoplasma, a banda do núcleo acaba ficando muito fraca. Sobre as perspectivas e discussões: Sim! Uma de nossas perspectivas é justamente realizar uma co-imunoprecipitação para ver se Akt e FOXK2 estão interagindo nos nossos modelos. Com relação ao papel diferencial de FOXK2 nos diferentes tipos de tumor, várias questões podem ser levantadas: (1) Já foi descrito que FOXK2 possui três variantes de splicing, cujas funções biológicas ainda não foram exploradas, mas essas variantes podem estar atuando de forma diferencial, dependendo do contexto tumoral; (2) Como você mencionou, FOXK2 pode estar regulando diferentes genes-alvo; (3) FOXK2 também pode estar interagindo com diferentes co-fatores no nível da cromatina, dependendo do tipo celular; (4) E também, dependendo do contexto, FOXK2 pode estar interagindo com diferentes proteínas, uma vez que cada modelo pode apresentar um perfil de expressão diferencial das proteínas de interação. Muito interessante sua pergunta, até abordamos essas discussões no nosso artigo de revisão (Nestal de Moraes et al., 2019, Cancers). Espero ter respondido suas perguntas! 

Murilo Rocha

Respondeu as perguntas sim Luciana. Dos experimentos apresentados todos foram feitos por você?
Author

Luciana da Torre Carneiro

Sim, sim!
Author

Luciana da Torre Carneiro

Olá, Rosane! Obrigada pela pergunta! Nós pretendemos avaliar o impacto da superexpressão de FOXK2 em conjunto com a inibição de AKT no fenótipo de sensibilidade às drogas nas células quimiorresistentes. Com isso, nós poderemos verificar se a inibição da regulação negativa de AKT sobre FOXK2 torna essas células mais sensíveis ao tratamento. Para a inibição de Akt, nós pretendemos realizar tanto a inibição gênica por siRNA quanto a inibição farmacológica, a partir do tratamento das células com MK2206. Já para a superexpressão de FOXK2, nós utilizamos uma transfecção plasmidial transiente, onde observamos que a superexpressão se mantém por até 8 dias. Espero ter respondido sua pergunta! 

Rosane Vianna-Jorge

Parabéns pelo trabalho, Luciana!
Author

Luciana da Torre Carneiro

Obrigada!!