EVALUATION OF THE IMMUNE SIGNATURE IN RESPONSE TO CHEMOTHERAPY IN PYMT MICE

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  • Presentation type: Mestrado
  • Track:
  • Keywords: Breast cancer; chemotherapy; Leukocyte infiltrate; Tumor microenvironment;
  • 1 INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (INCA)

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: The cells of the immune system influence both the control and the development of cancer. The knowledge of the leukocyte infiltrate allows to understand and evaluate the efficiency of several antitumor therapies, allowing the optimization of existing therapeutic approaches and the development of new therapies. The use of murine models allows us to review the complexity of human tumor development and microenvironment. In this project, a transgenic murine model that develops breast cancer, the PyMT mice, will be used. Tumor development in these animals is histologically and genetically comparable to breast cancer in humans, being able to reproduce many forms of this disease. Breast cancer is the leading cause of cancer death among women worldwide. Currently, anthracyclines followed by taxane are used for the chemotherapy treatment of breast cancer, but there is no biological basis to support this order, and this sequence was established in the order in which these chemotherapeutic drugs were started. NeoSamba: Randomized phase II trial study (INCA) demonstrated that there was better overall and disease-free survival in patients treated with the reverse order of chemotherapy blocks: taxane followed by anthracyclines. Based on the rationale of this protocol, the impacts of neoadjuvant treatment with combinations of anthracyclines (5-fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide - FAC) will be inferred followed by taxane (docetaxel) and the reverse order (taxane followed by FAC) on the leukocyte infiltrate in the murine model PyMT.

MATERIAL AND METHODS: In this study, PyMT mice will be treated once a week, with an interval of one week between the chemotherapy arms. Each arm will last for 3 weeks. After treatment, tumor dissociation will be performed and the infiltrate will be analyzed by flow cytometry and RNA sequencing (RNA-Seq).

RESULTS AND CONCLUSION: As initial results, we made tumor growth curves, defining the sizes of the tumors to be collected for the analysis and toxicity tests, setting the doses for chemotherapy treatments. As a next step, we will start treating the animals and assess their leukocyte infiltrate qualitatively and quantitatively after each of the chemotherapy blocks, after the complete sequence of therapy in the standard order and also in the inverted order. In this way, we hope to characterize the impact of different chemotherapeutic regimes on the tumor immune response.

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Mariana Duarte

Olá Roberta, obrigada pelo seu comentário. Sim! Montamos um painel de marcadores que nos permite identificar diferentes populações de células imunes por citometria de fluxo, levando em consideração fenótipos importantes associados ao prognostico do tumor, como macrófagos M1 e M2, subpopulações de linfócitos T CD4+ como Th1, Th2, Th17 e Treg, linfócitos ativados e exaustos, entre outros. Nosso painel de marcadores foi pensado para identificarmos 20 populações e subpopulações de células imunológicas intratumorais, além de cancer stem cells, células endotelidais e células em proliferação.  O câncer de mama precoce de alto risco  são tumores diagnosticados como câncer de mama invasivo nos estágios iniciais (estágios I ou II), mas são tumores que apresentam tamanho > 20 mm, e as células cancerígenas se espalharam além do local original e no tecido mamário circundante. O diagnostico pode ser realizado por analise histológica.

Roberta Saldanha Gama

Obrigada pelas explicações, Mariana. 
Author

Mariana Duarte

Olá Nathalia, agradeço seu comentário. Alguns trabalhos já mostraram o impacto de taxano ou antraciclina na modulação imunológica. Os taxanos podem causar um efeito direto nos hepatócitos, causando uma hipersensibilidade do tipo I (relacionado com reações alérgicas), modulando a imunidade para o tipo Th2, levando a produção de citocinas IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, e induzindo um remodelamento tecidual e imunossupressão do microambiente tumoral. Enquanto as antraciclinas levam a um aumento na proporção de células T CD8+ e IFN gamma. Esse é nosso embasamento teórico, junto com os estudos do NeoTANGO e NeoSAMBA, além outros estudos associando assinatura imune com prognostico após o tratamento com quimioterápicos taxano (como o estudo do DENARDO, et al. 2011) usando o modelo murino PyMT mas com background FVB, eu vou utilizar com background B6, que desenvolve tumor mais lentamente o que permite um tratamento mais longo e diversos estudos relacionando o infiltrado imune com prognostico em pacientes com câncer de mama. Pretendo analisar um painel maior com 20 populações e subpopulações de células imunológicas, além cancer stem cells, células endotelidais e células em proliferação. Eu acredito que veremos uma modulação seguindo essa linha, nossa teoria é que após o tratamento com taxano veremos um perfil imunológico com uma assinatura imune e vias de sinalização (por RNAseq) indicando remodelamento tecidual, um microambiente imussupressor, condições um pouco mais favoráveis ao tumor, com Treg, Th2, TAMs do fenótipo M2, TANs, células com fenótipo de exaustão, entre outros. Enquanto que após antraciclinas, acreditamos ver um perfil mais inflamatório, com células citotóxicas CD8+ e NK por exemplo, TAMs do fenótipo M1, citocinas inflamatórias como IFN gamma, entre outras. Então, quando invertermos a ordem, com taxano seguido de antraciclinas, a modulação irá tender para um perfil mais inflamatório, o que pode ser uma das explicações para o aumento da sobrevida observada nas pacientes do estudo do NeoSamba. O estudo será descritivo, buscando entender de um ponto de vista imunológico, o aumento da sobrevida quando inverte a ordem de tratamento padrão para câncer de mama, com isso podemos demonstrar que existe uma explicação biológica dá ordem de administração, o que pode levar a melhoria da sobrevida global e sobrevida livre de doença de muitas pacientes com câncer de mama. Temos o CEUA aprovado (parecer 003/19) com um N de 5 animais por grupo. A divisão entre tumores iniciais e avançados foi determinada por analises histológicas de H&E para definir os estágios do tumor. Os tumores entre 100-300 mm², apresentam características dos estágios de adenoma/MIN e carcinoma precoce e tumores maiores que 800 mm³ apresentam características de carcinoma tardio. Sim, faremos também analises de imunohistoquímica para definir os biomarcadores. Os biomarcadores no modelo murino PyMT já é bem definido em cada estágio. Os estágios pré-malignos e malignos incluem hiperplasia, adenoma/neoplasia intraepitelial mamária (MIN), carcinoma precoce e carcinoma tardio, apresentando perda gradual dos receptores estrogênio (ER) e progesterona (PR), ao passo que superexpressa as proteínas ErbB2/Neu e ciclina-D1, além da expressão alterada da integrina β. Esses serão os marcadores que usaremos para definir os estágios. Nas analises de citometria, usaremos um painel para identificar as seguintes populações: Macrofagos M1 e M2, células mieloides imaturas, granulócitos (eosinófilos e neutrófilos), células dendríticas, linfócitos T de memória (naive, memoria central, memoria efetora e memoria efetora RA), linfócitos T CD8+, linfócitos T CD4+ (Th1, Th2, Th17 e Treg), linfócitos ativados e exaustos, células B, NK, células endoteliais, γδ T cell, cancer stem cells e células em proliferação. Faremos analises de RNA-seq da deconvolução de tumores, análise de repertório de linfócitos T e B (TCR e BCR), padrão de expressão gênica e de vias de sinalização que indiquem os processos de resposta imune em curso. Estou a disposição caso tenha mais alguma pergunta.   Obrigada

Nathalia Meireles

Muito obrigada pela resposta! Boa sorte na continuação do seu trabalho!