Regulação da enzima GlnD de Herbaspirillum seropedicae

Introdução: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio capaz de se associar a plantas economicamente importantes e estimular o crescimento das mesmas. A fixação biológica de nitrogênio é um processo fortemente regulado pelo sistema conhecido como Ntr, que inclui a família das proteínas PII de transdução de sinal, GlnB e GlnK. A enzima bifuncional GlnD possui um papel importante na regulação do sistema Ntr, atuando como uma unidade de controle central no metabolismo de nitrogênio determinado pelo nível de glutamina na célula, primeiro composto nitrogenado derivado da assimilação do amônio. GlnD é responsável por controlar o estado de modificação pós-traducional das proteínas da família PII: ela catalisa tanto a uridililação (UTase) quanto a desuridililação das proteínas PII (UR), as quais estão envolvidas em diversas cascatas de regulação metabólica. Dentre os quatro domínios da proteína GlnD, encontram-se dois domínios ACT C-terminais, supostamente envolvidos no sensoriamento de sinais ambientais. A regulação recíproca das atividades opostas UR e UTase de GlnD é essencial para a modulação do metabolismo bacteriano, no entanto nem todos os detalhes dessa regulação são conhecidos. Deste modo, o presente trabalho investigou a regulação das atividades UTase e UR de GlnD de H. seropedicae sobre GlnK e o efeito da presença de efetores alostéricos. Métodos: As proteínas envolvidas no processo foram purificadas, e o estado de modificação pós-traducional das proteínas PII foi avaliado por gel de eletroforese não desnaturante. Resultados: Demonstramos por modificação proteica in vitro que a atividade UR de GlnD é fortemente estimulada por glutamina e inibida por 2- oxoglutarato (2-OG). A deleção dos domínios ACT C-terminais causa uma perda de regulação tanto da atividade UTase, quanto da atividade UR. Através de um alinhamento de domínios regulatórios ACT, aminoácidos conservados desses domínios foram escolhidos para sofrer mutagênese pontual sítio dirigida. A proteína contendo a mutação pontual A713D já foi construída, e a verificação da sua atividade in vitro mostrou que é capaz de uridililar GlnK normalmente, e essa atividade UTase é regulada da mesma forma que a selvagem, inclusive com inibição por glutamina. No entanto, a proteína A713D perdeu a atividade UR em qualquer condição, indicando que possivelmente a sensibilidade a glutamina dessa atividade foi perdida. Portanto, é possível que existam dois sítios de ligação de glutamina na proteína com funções diferentes, um para estímulo da atividade UR, outro para inibição da atividade UTase. No entanto a confirmação dessa informação necessita de mais experimentos. Conclusões: Os resultados apresentados sugerem que a enzima GlnD de H. seropedicae é capaz de sensoriar a razão glutamina/2-OG, assim como realizar a ligação com esses efetores. Os resultados também indicam que o domínio ACT é um sensor de sinais ambientais que indica a disponibilidade de nitrogênio.