Padronização do Armazenamento e Processamento de Amostras Teciduais de Animais Mortos por Atropelamento para Uso em Técnicas Moleculares

Em determinadas condições de umidade e calor, o DNA pode sofrer degradação biológica por enzimas de origem bacteriana, fúngica e até da própria célula que o alberga. Pesquisadores sabendo disso ficam receosos com relação à forma de conservar, armazenar e manusear suas amostras. Não existe na literatura estudos científicos que tratem da viabilidade e durabilidade do DNA de amostras teciduais de órgãos de animais silvestres que vão a óbito em rodovias e lá ficam expostos por algumas horas. Essas amostras têm sido alvo de diversos estudos científicos que tratam da conservação da fauna silvestre e de epidemiologia de doenças zoonóticas nesses animais. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi padronizar técnicas de armazenamento e processamento de amostras teciduais de animais silvestres mortos por atropelamento de forma a obter uma quantidade e qualidade de DNA suficientes para uso em técnicas de diagnóstico molecular. Um gambá-de-orelha-branca (Didelphis albiventris) morto por atropelamento foi coletado em uma rodovia da região Central do estado do Paraná em estado de rigor mortis. Fragmentos de baço foram aliquotados e cada alíquota armazenada em uma condição diferente: (1) -20°C, (2) -80°C e a última a (3) -20°C com etanol absoluto. Após 30 dias de congelamento, as amostras de baço foram submetidas à extração de DNA, na etapa final cada extraído foi submetido a duas diferentes formas de eluição: (.1) água e (.2) TE. Obtivemos um total de seis protocolos: 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 3.1 e 3.2, os quais, após a extração, foram novamente submetidos a diferentes formas de armazenamento: temperatura ambiente (TA), geladeira (G) e congelador (C). Todos os extraídos foram submetidos semanalmente a quantificação, a fim de analisar a concentração e pureza do DNA; além disso, em uma alíquota de extraído congelado a aferição era mensal. Essas mensurações foram realizadas durante três meses e os resultados foram tabulados no programa Excel. Os resultados das análises demonstraram que o armazenamento de DNA extraído a longo prazo em temperatura ambiente e geladeira (-4°C) não é viável, pois ocorre crescimento fúngico e, consequentemente, contamina a amostra. O DNA quando armazenado sob congelamento começou a apresentar queda na concentração após a nona semana, ou seja, após oito descongelamentos; o DNA submetido a descongelamentos mensais, no período de três meses, manteve sua concentração. Com relação às temperaturas de armazenamento pré-extração, a maior concentração de DNA extraído no dia 1 foi obtida na temperatura -20°C (144,5 ng/uL), seguida da -20°C em álcool absoluto (98,2 ng/uL) e da -80°C (93,7 ng/uL). No que diz respeito à solução usada na eluição do DNA, quando utilizada a água a concentração média obtida no dia 1 foi 128 ng/uL, quando utilizada a TE foi 87 ng/uL; no entanto, a queda na concentração do DNA quando utilizada a água foi mais brusca. Conclui-se que amostras teciduais de animais silvestres mortos por atropelamento devem ser armazenadas a -20°C logo após a coleta, a solução de eluição deve ser escolhida de acordo com o objetivo do estudo, deve-se evitar ao máximo congelar e descongelar os extraídos de DNA.