Os Efeitos Fotodinâmicos do Azul de Orto-toluidina sobre a Biossíntese Mitocondrial de ATP e a Gliconeogênese Hepática

Introdução: O azul de orto-toluidina (AOT) tem sido estudado devido sua empregabilidade como fotossensibilizador (F) na terapia fotodinâmica (TFD), uma modalidade em ascensão para o tratamento de alguns tipos de cânceres. A interação entre o F ativado pela luz e o oxigênio resulta na formação de espécies reativas de oxigênio responsáveis por promover efeitos citotóxicos sobre as células-alvo. Estudos anteriores realizados por nosso grupo de pesquisa indicaram que o AOT inibe a fosforilação oxidativa mitocondrial, o que poderia comprometer diferentes vias biossintéticas. Desta forma, o presente estudo teve como objetivos avaliar os efeitos diretos e fotodinâmicos do AOT (40 μM) sobre a taxa de síntese do ATP em mitocôndrias isoladas e os efeitos diretos do AOT na mesma concentração sobre a gliconeogênese hepática, uma via estritamente dependente de ATP. Métodos: Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar (180─280 g). Mitocôndrias hepáticas foram isoladas por centrifugação diferencial. Após, foram pré-incubadas durante 10 minutos na ausência ou presença de AOT e irradiadas (ou não) com um sistema de diodo emissor de luz vermelha (636 nm, 2,6 mW  cm2), fornecendo, portanto, uma dose de energia total de fótons (fluência) de 1,6 J  cm-2. Após este período, a taxa da biossíntese mitocondrial de ATP foi medida em mitocôndrias intactas acopladas (3,33 mg de proteína  mL-1) na presença de succinato (20 mM) e rotenona (5 µM) ou malato (20 mM) e glutamato (20 mM) e ADP (1 mM). O ATP produzido foi quantificado com um cromatógrafo líquido de alta eficiência a 254 nm. Perfusões hepáticas foram realizadas utilizando fígados de ratos sob jejum de 12 h. Lactato (2 mM) e piruvato (0,2 mM) foram utilizados como substratos gliconeogênicos. A produção de glicose foi avaliada enzimaticamente e o consumo de oxigênio foi medido polarograficamente. Resultados: Quando malato e glutamato foram utilizados como substratos a taxa biossintética do ATP em mitocôndrias isoladas foi inibida tanto sob irradiação (- 98%), como na ausência de irradiação (-85%). Em experimentos nos quais o succinato foi utilizado como substrato oxidável, a taxa biossintética do ATP também foi inibida em ambas as condições (-80% sem irradiação e -98% com irradiação). Nos experimentos de perfusão hepática, o AOT inibiu a gliconeogênese a partir de lactato e piruvato de forma progressiva e, no final, muito acentuada, chegando a uma inibição máxima de 68%. Após interrupção da infusão de AOT houve apenas uma recuperação parcial na produção de glicose. O consumo de oxigênio teve um estímulo máximo de 9% aos 6 minutos de infusão de AOT, sem recuperação após sua retirada. Conclusão: A inibição da gliconeogênese é, provavelmente, uma consequência da inibição da fosforilação oxidativa mitocondrial, que ocorreu sob irradiação ou não. Aparentemente, o AOT exerce efeito desacoplador. Considerando a similaridade do metabolismo mitocondrial em diferentes tecidos, outros processos metabólicos dependentes de ATP poderiam ser afetados. Um possível efeito adverso seria a hipoglicemia devido à inibição da produção de glicose. Tais alterações metabólicas poderiam limitar o uso do AOT na Terapia Fotodinâmica e outras modalidades clínicas.