Influência da Lise Celular em Análise Metabolômica da Ruminococcus flavefaciens por UHPLC-MS/MS e Molecular Networking

Introdução: Ruminococcus flavefaciens é uma bactéria celulolítica presente no rúmen tendo como principal característica a capacidade de degradar material vegetal. O estudo metabolômico desta bactéria por Cromatografia Líquida acoplada a espectrometeria de massas (UHPLC-MS /MS) em associação à ferramenta Molecular Networking (MN) é capaz de fornecer uma visão abrangente de seu metabolismo e auxiliar na identificação de novas enzimas e compostos relacionados à degradação da biomassa. Neste estudo, foram avaliados os efeitos da lise celular na extração dos metabólitos intracelulares da bactéria empregando métodos mecânicos. Métodos: Amostras das células bacterianas foram extraídas com metanol (-20°C) em associação à sonicação em banho de ultrassom (LimpSonic) a 20 Hz/5 mim e utilizando probe de sonicação (QSonica Q55) sob as mesmas condições. A influência destes processos foi avaliada em comparação à extração utilizando somente metanol (-20°C), com posterior agitação em vórtex durante 30 s. Os extratos foram analisados por UHPLC-MS/MS e Molecular Networking. Resultados: No total, 152 entidades químicas foram observadas a partir das análises. Destes, 110 compostos foram observados nas extrações pelos três métodos utilizados, evidenciando que, neste caso, o rompimento da parede celular da bactéria pode não ser tão determinante na quantidade de metabólitos extraídos. A caracterização dos metabólitos foi realizada a partir do confronto dos espectros de massas experimentais com o banco de dados da plataforma do GNPS (Global Natural Social Products). Dentre os metabólitos identificados, somente a prolilfenilalanina teve sua extração favorecida exclusivamente pelos métodos de sonicação. A extração dos demais metabólitos não foi favorecida pelos diferentes métodos utilizados. Para a extração utilizando metanol a frio, a alta permeabilidade à membrana e a baixa temperatura contribuíram para a extração dos metabólitos intracelulares. Conclusões: Estes resultados contribuem para a otimização de processos de extração em estudos de metabolômica de microrganismos, principalmente Gram-positivos. Apenas o uso da extração com solvente, sem ruptura mecânica, mostrou-se mais adequado para a obtenção dos metabólitos intracelulares.