Caracterização da Proteína Glutamina Sintetase de Herbaspirillum seropedicae

Introdução: A principal fonte de nitrogênio para a maioria das bactérias é o amônio. A assimilação dessa molécula consiste na sua condensação com o esqueleto carbônico do 2-oxoglutarato (2-OG) para formar glutamato e glutamina os quais, por sua vez, irão servir como doadores de grupo amino para reações biossintéticas da célula. A via mais importante de assimilação de amônio possui duas enzimas: glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase (GOGAT). Na primeira etapa dessa via, GS catalisa a condensação do amônio à uma molécula de glutamato para formar glutamina. Na segunda etapa da assimilação, a glutamina formada por GS sofre uma transaminação com 2-OG para formar duas moléculas de glutamato. O fluxo metabólico através dessa via é fortemente regulado, sendo GS o principal alvo de regulação, que ocorre tanto alostericamente quanto por modificação pós-traducional. As vias de transdução do sinal de nitrogênio para esse sistema foram parcialmente descritas para alguns organismos, mas ainda não foi totalmente esclarecida. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivo expressar e caracterizar a enzima GS selvagem de Herbaspirillum seropedicae, bem como variantes enzimáticas contendo mutações pontuais sítio-dirigidas, para que no futuro a regulação da via de assimilação de amônio de H. seropedicae possa ser caracterizada in vitro. Metodologia: O gene codificante da proteína GS de H. seropedicae foi amplificado por PCR e clonado em vetor de expressão. Além disso, utilizando o método de PCR com primers mutagênicos complementares, foram construídas 5 variantes do gene que codificam proteínas GS com as seguintes mutações pontuais: H250R, L293R, P349L, G54C e G130S. Após confirmação da clonagem e da superexpressão, GS foi purificada por cromatografia de afinidade. A atividade de GS foi avaliada por ensaios colorimétricos através de duas reações catalisadas por essa enzima: a biossintética e a γ-glutamiltransferase. Resultados: O plasmídeo para superexpressão da enzima GS de H. seropedicae foi construído, e a enzima GS fusionada a cauda-His foi purificada com pureza superior a 95% concentração de 5mg/mL. A enzima GS purificada apresentou atividade em ambas as reações (biossintética e a γ-glutamiltransferase), e a atividade foi detectável mesmo na menor concentração enzimática testada (50 nM). Ensaios de inibição da atividade transferásica de GS por íons Mg2+ indicaram que a GS purificada se encontra majoritariamente no estado não modificada. As proteínas com as mutações H250R e G54C conferiram à estas variantes mutantes alta atividade GS. Já as mutações L293R E P349L levaram a uma menor atividade GS. Os fenótipos dessas mutações ainda serão mais explorados na continuiade do trabalho. Conclusão: A enzima GS purificada e as enzimas expressas pelas variantes mutantes no presente trabalho estão sendo utilizadas para a reprodução in vitro do sistema de regulação da assimilação de amônio de H. seropedicae, para que as vias de transdução de disponibilidade de amônio possam ser descritas.