Clonagem e expressão heteróloga de uma L-asparaginase II de Bacillus subtilis: estudos preliminares de um potencial biofármaco

Introdução: A L-asparaginase tipo II é uma proteína terapêutica utilizada no tratamento da Leucemia Linfóide Aguda, um câncer que acomete especialmente crianças. Sua ação enzimática consiste em hidrolisar L-asparagina, um aminoácido imprescindível na manutenção nutricional e multiplicação dos linfoblastos leucêmicos. A ausência deste aminoácido livre no plasma impede a proliferação da célula tumoral, devido à ausência da enzima asparagina sintetase neste tipo celular. As principais L-asparaginases empregadas nos tratamentos quimioterápicos são provenientes das bactérias Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi. No entanto, tem sido relatado na literatura inúmeros casos de pacientes sob tratamento com ambas proteínas que, em graus variados, apresentaram reações alérgicas ou de hipersensibilidade (Appl Biochem Biotechnol. 178:900,2016). Portanto, torna-se importante a busca por outras fontes de L-asparaginase II, que possam propiciar um tratamento mais eficaz e com menor efeito secundário. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi amplificar e clonar o gene de uma L-asparaginase II (ansZ) de Bacillus subtilis no vetor pET28a, para expressão da proteína recombinante em Escherichia coli. Métodos. O DNA genômico de B. subtilis foi amplificado por PCR utilizando os primers Fw e Rv, que contém sítios de reconhecimentos das enzimas de restrição NheI e BamHI respectivamente. O produto da amplificação foi digerido com estas enzimas e ligado ao vetor de expressão pET28a, que codifica uma sequência rica em histidinas (His-Tag) no N-terminal da proteína expressa. Os clones obtidos foram sequenciados e após verificação da sequência correta do gene, o plasmídeo recombinante ansZ-pET28a foi transformado em E. coli Rosetta e cultivado em 50 ml de meio LB. Após a cultura atingir a D.O600nm de 0.5 a indução da expressão foi feita pela adição de 0.5 mM de IPTG, seguido pelo cultivo por 4 horas a 37oC, sob agitação orbital a 180 rpm, sendo separadas alíquotas de 1 mL a cada hora, centrifugadas a 7.000g por 5 minutos com descarte do sobrenadante e armazenamento da fração celular a -20oC. Ao final da expressão, a cultura foi centrifugada e a membrana plasmática rompida por sonicação. A expressão protéica a cada hora, bem como a solubilidade da enzima recombinante, foram avaliadas por eletroforese (SDS-PAGE) em gel de poliacrilamida 12%. Resultados: A amplificação e clonagem do gene ansZ em pET28a foi visualizada por PCR de colônias e confirmada por sequenciamento gênico, que mostrou que a sequência de DNA recombinante não continha mutação. A expressão da L-asparaginase II de B. subtilis em E. coli foi analisada por SDS-PAGE, tendo sido visualizadas bandas no gel em torno de 45 kDa que aparecem a partir da primeira hora de expressão, continuando de forma progressiva até a quarta hora, sendo este o tamanho predito da enzima recombinante, de acordo com sua sequência primária. Análise da solubilidade citoplasmática da enzima mostrou que ela foi expressa predominantemente de forma solúvel, não sendo constatado formação considerável de corpos de inclusão. Conclusão: Conclui-se que o gene ansZ foi clonado e expresso com êxito em E. coli Rosetta. A proteína recombinante foi obtida predominantemente na forma solúvel, indicando um correto enovelamento e não formação de agregados, o que facilita assim sua posterior purificação e caracterização, visando avaliar seu potencial uso como biofármaco. Apoio financeiro: Funcap, CNPq e Fiocruz-VPPLR.