Desvendando o Papel da Glutarredoxina A1 de Corynebacterium pseudotuberculosis na Patogenicidade em Células Hospedeiras

O Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) é uma bactéria Gram-positiva, facultativamente intracelular, e o agente etiológico da linfadenite caseosa (LC) em pequenos ruminantes, uma doença com impactos econômicos significativos e potencial risco zoonótico. A cronicidade e o sucesso da infecção dependem da capacidade do patógeno de sobreviver no ambiente intracelular e modular as respostas do hospedeiro. Estudos proteômicos revelaram que o secretoma de C. pseudotuberculosis sofre remodelamento substancial durante a infecção, com destaque para a secreção induzida pelo hospedeiro de uma proteína semelhante à glutaredoxina A1 (Cp-GrxA1).

As proteínas Cp-GrxA1 são oxidorredutases tiol-dissulfeto que desempenham papel central na manutenção da homeostase redox intracelular, catalisando a redução de dissulfetos proteicos e dissulfetos mistos formados com tióis de baixo peso molecular. Embora tradicionalmente intracelulares, evidências recentes demonstram que proteínas redox ativas podem ser secretadas por vias não convencionais e atuar como fatores associados à virulência, modulando o microambiente do hospedeiro de forma a favorecer a colonização pelo patógeno. Entretanto, o impacto específico da Cp-GrxA1 secretada por C. pseudotuberculosis em células de mamíferos ainda é desconhecido, levando à hipótese de que essa proteína possa subverter ativamente a maquinaria celular.

As interações patógeno-hospedeiro frequentemente envolvem a modulação de estruturas subcelulares críticas, incluindo o citoesqueleto do hospedeiro, que é frequentemente alvo de patógenos para facilitar a invasão e a sobrevivência intracelular. As mitocôndrias também constituem alvos-chave durante a infecção, desempenhando funções centrais na bioenergética, imunidade inata e apoptose. 

Nesse contexto, nossa hipótese central propõe que fatores de virulência redox-ativos desempenham papel importante na modulação de vias de sinalização do hospedeiro, afetando a organização do citoesqueleto e a função mitocondrial. Essas alterações podem comprometer a homeostase celular e influenciar diretamente a resposta da célula frente à infecção e ao estresse desencadeado por fatores patogênicos. 

Para capturar a complexidade dessas respostas celulares à exposição à Cp-GrxA1 recombinante, é essencial uma abordagem analítica integrativa. Utilizando a linhagem murina de células progenitoras hepáticas MLP-29 como modelo in vitro, este estudo emprega uma combinação de ensaios fenotípicos e biologia de sistemas. Microscopia confocal e citometria de fluxo são utilizadas para mapear a internalização proteica, alterações estruturais e viabilidade celular. Paralelamente, a avaliação mecanística é aprofundada por meio de técnicas de biologia molecular, incluindo análises de RT-qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa após Transcrição Reversa, do inglês Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction) e abordagens ômicas globais, integrando proteômica baseada em espectrometria de massas e metabolômica baseada em RMN de ¹H. Essa abordagem permite correlacionar fenótipos visuais com o remodelamento em tempo real de vias de sinalização, desde a expressão gênica até os fluxos metabólicos. 

As análises de RMN foram realizadas em um sistema Bruker IVDr de 600 MHz (Bruker), equipado com autosampler SampleJet com controle de temperatura (5 °C), sonda broadband BBI com gradiente em z e sistema de shim BOSS-III. Antes das aquisições diárias, o equipamento foi calibrado com padrões de metanol, QuantRef e sacarose, garantindo estabilidade térmica (310 K), precisão quantitativa e otimização de homogeneidade de campo. Cada amostra foi submetida a experimentos de RMN de ¹H do tipo 1D NOESY (32 scans), permitindo quantificação absoluta dos metabólitos em mmol L⁻¹ por meio da plataforma B.I. BioBankQuant-PS™.

Os resultados demonstraram que a Cp-GrxA1 induz citotoxicidade dependente da dose, com redução significativa da viabilidade celular em concentrações ≥ 50 µmol L⁻¹ e intenso remodelamento estrutural em concentrações subletais. A análise proteômica das células MLP-29 revelou alterações em vias relacionadas à adesão celular, organização do citoesqueleto e função mitocondrial, incluindo repressão da sinalização integrina-citoesqueleto e predição de inibição da resposta antioxidante mediada por NRF2. A expressão gênica corroborou esses achados, demonstrando aumento de Smad4, α-SMA e nrf2, além de redução de COX5b.

A metabolômica intracelular por RMN de ¹H mostrou redução de glicina, alanina, treonina e acetato, associada ao aumento de leucina, isoleucina e succinato, indicando comprometimento do metabolismo de aminoácidos e do ciclo TCA. No meio extracelular, observou-se diminuição de glicina e citrato, acompanhada de aumento de piruvato, sugerindo reprogramação energética associada ao estresse mitocondrial. Esses resultados indicam que a Cp-GrxA1 atua como um potencial fator de virulência não convencional em C. pseudotuberculosis, ampliando a compreensão das interações patógeno-hospedeiro e destacando o potencial da metabolômica por RMN na investigação de mecanismos moleculares associados à patogênese bacteriana.