Objetivos: Pesquisar e quantificar tanto o DNA do Vaccinia virus (VACV) através da PCR em tempo real quanto pesquisar partículas infecciosas do vírus nas amostras de leite de animais previamente inoculados com o VACV amostra GP2 e submetidos a tratamento imunodepressor. Métodos: Quatro animais foram tratados com dexametasona via intramuscular, na dose de 0,1mg/Kg/dia, durante cinco dias consecutivos, contados a partir do 69º dia pós inoculação (d.p.in). Diariamente, do 69º até o 81º d.p.in, as amostras de leite foram ordenhadas e submetidas à PCR em tempo real para amplificação do gene vgf. As amostras positivas no PCR foram submetidas à técnica de imunoperoxidase em monocamada de células (IPMC) para pesquisa de partículas virais infecciosas. Resultados: Foi possível detectar tanto DNA do VACV com quantificação média de 4,5 x 103 unidades genômicas (UG)/ml quanto partículas virais viáveis nas amostras de leite. Conclusões: A detecção do VACV no leite de animais sem sintomatologia da vaccinia bovina (VB), zoonose causada pelo VACV, chama a atenção para o potencial risco à Saúde Pública associado ao consumo de leite de vacas que não apresentam lesões ulceradas nas tetas.