Transfecção celular da construção pCAG-GFP-ROSA26 via CRISPR-Cas9 em células epiteliais da glândula mamária bovina

A utilização de linhagens celulares como biorreatores pode ser utilizada como importante fonte para produção de biofármacos. Por sua vez, o cultivo de linhagens celulares transgênicas permite o uso das mesmas como doadoras de núcleo para protocolos de transferência nuclear para a produção de animais geneticamente modificados. A produção de proteínas recombinantes pelo cultivo de células epiteliais da glândula mamária bovina (bMECs) tem importantes vantagens devido a sua produção em larga escala, além de possuir a maquinaria de modificações pós-traducionais necessárias para algumas proteínas, o que pode ser utilizado como modelo para a produção de proteínas recombinantes a partir da glândula mamária de animais transgênicos. O atual projeto visa inserir a construção pCAG-GFP-ROSA26, via sistema de edição gênica CRISPR-Cas, em bMECs cultivadas, como forma de avaliar a taxa de incorporação do transgene, além de utilizá-lo como modelo de estudo para incorporação e expressão gênica. Ademais, as bMECs transfectadas poderão ser utilizadas como doadoras de núcleo para produção de embriões transgênicos. A construção do plasmídeo pCAG-GFP-ROSA26 será realizado através da amplificação dos fragmentos pCAG-GFP (green fluorescent protein) e das sequências do 3’ARM e 5’ARM do gene ROSA26 bovino, e a posterior fusão dos fragmentos purificados. Posteriormente, o plasmídeo construído será inserido em bMECs cultivadas, via sistema CRISPR-Cas, por meio dos protocolos de lipofecção e eletroporação. As bMECs transfectadas terão sua viabilidade celular avaliadas antes e após a transfecção celular, pela marcação com Hoechst e iodeto de propídeo. A incorporação da construção pCAG-GFP-ROSA26 nas células após a transfecção será identificada por genotipagem utilizando o protocolo de PCR e a quantificação dos transcritos GFP por Real Time - qPCR. No momento, o projeto encontra-se na fase de purificação dos fragmentos e a posterior fusão para a construção plasmidial pCAG-GFP-ROSA26. Espera-se com este projeto estabelecer a técnica de cultivo de bMECs que resulte no estabelecimento de linhagens celulares doadoras de núcleo, e padronizar o protocolo de transfecção celular da maquinaria de CRISPR-Cas contendo a construção de pCAG-GFP-ROSA26. Adicionalmente, é previsto que seja possível identificar a incorporação do gene GFP nas bMECs transfectadas.