Peptídeo desenhado WR é internalizado pelas células de Candida albicans e ion K+ reverte a morte celular induzida

Devido a crescente resistência dos microrganismos a antibióticos utilizados atualmente, há a necessidade de novas substâncias terapêuticas. Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são moléculas de defesa dos organismos e possuem vasta atividade inibitória sobre microrganismos sendo, portanto, uma classe promissora de novas substâncias terapêuticas. Nosso grupo vem trabalhando com um AMP denominado Vu-Def1, da família das defensinas, isolado de Vigna unguiculata (feijão-de-corda). A partir do γ-core de Vu-Def1 e de um estudo onde correlacionamos a estrutura primária dos γ-cores e a atividade biológica de diversas defensinas, desenhamos o peptídeo A42,44R37,38W36-39γ32-46Vu-Def (WR), mais catiônico e hidrofóbico que o original, com o intuito de melhorar sua atividade biológica. Previamente, WR demonstrou forte atividade antifúngica sobre leveduras do gênero Candida, e baixa toxicidade para monócitos humanos e macrófagos murinos. Para C. albicans foi determinada a dose letal de 27,5µM e tempo de morte de 1h. Verificamos por diversas sondas que WR afeta organelas intracelulares com destaque para disfunção vacuolar e mitocondrial que induz morte celular acidental em C. albicans. Porém observamos encolhimento celular que não é associado com este tipo de morte. Devido a disfunção observada em organelas intracelulares e o encolhimento celular, o objetivo deste trabalho foi estudar a interação e a entrada de WR em C. albicans e também analisamos o papel do íon K+, descrito como regulador do volume celular em fungos. Para isso fizemos um ensaio com 100 e 200mM de fosfatos de K+ e Na+, CaCl2 e 5mM EGTA, onde observamos que todos os íons reverteram parcialmente a morte. Para determinar se WR entra na célula, fizemos o ensaio em microscópio confocal com Calcofluor White 2% e WR marcado com o fluoróforo 5-FAM e concluímos que houve a internalização de WR, e que a entrada ocorrer mesmo na presença de K+ indicando que a proteção observada anteriormente pode não estar relacionada com bloqueio da carga entre WR e da superfície celular. Para diferenciarmos o efeito de interação com membranas, testamos a atividade hemolítica de WR e não houve lise de eritrócitos, e usando Dicroísmo Circular analisamos as interações biofísicas de WR com modelos de membranas artificiais (SUVs). Observamos que em água ou em fosfato de K+ ou Na+ e na presença de POPC, POPC/POPE ou ergosterol 15 e 35% a conformação de WR é desordenada e apenas em TFE (100%) e POPC/POPG, há a formação de α-hélices. Nossos resultados sugerem que WR não tem como alvo a membrana plasmática e os íons não bloqueiam carga, mas, repõem o que a células está perdendo, bloqueando o sinal que leva à morte.