Estabelecimento de protocolo de indução da secreção de proteínas do leite em cultura de células epiteliais de glândula mamária bovina

Linhagens celulares têm sido utilizadas com êxito para produção de proteínas recombinantes de interesse humano, usando animais, plantas e/ou microrganismos geneticamente modificados. As células epiteliais da glândula mamária bovina (bMECs) apresentam vantagens em relação à secreção de proteínas reguladas por promotores gênicos que respondem a estímulos hormonais, permitindo a
produção de biofármacos para tratar diversas doenças humanas, com todas as modificações póstraducionais necessárias. O desenvolvimento de linhagens de bMECs capazes de secretar proteínas do leite após protocolos de indução poderá servir de modelo para produção de proteínas recombinantes em animais transgênicos. Ao suplementar o meio de cultura com hormônios é possível
obter níveis de proteínas semelhantes aos encontrados no tecido in vivo, permitindo o uso dessas linhagens celulares como doadoras de núcleo para produção de biorreatores geneticamente modificados pela técnica de clonagem por transferência nuclear. Para tal, o atual projeto visa estabelecer protocolos que promovam a indução das bMECs a secretarem proteínas do leite durante o cultivo in vitro, com ou sem matriz extracelular. Será realizada a identificação das proteínas do leite no meio de cultura, após indução, por Western-Blotting. Será ainda avaliada a expressão dos marcadores de expressão gênica da glândula mamária (CSN2, BLG e BTN1A1) por Real Time - qPCR. As culturas de bMECs serão distribuídas em quatro tratamentos, na presença ou ausência de matriz extracelular (concentração de 0,2mg e 5 mg), além de um cultivo de fibroblastos como controle negativo. A indução da secreção de proteínas será realizada pela suplementação do meio de cultura com insulina, hidrocortisona, progesterona, estradiol e EGF. Resultados preliminares mostram que as características morfológicas de bMECs foram perdidas após três passagens celulares em meio de cultivo sem indução e sem matriz, sendo esta confirmada após a não identificação dos marcadores
gênicos. O cultivo de fibroblastos (até a décima passagem), apresentou transcrição gênica somente para BLG, corroborando com dados na literatura. Com o sucesso ao isolar as bMECs, o cultivo do grupo com indução e sem matriz foi iniciado e coletadas amostras até a segunda passagem, sendo no momento analisadas qualitativamente a presença dos marcadores gênicos da glândula mamária.
Portanto, o protocolo de cultivo foi estabelecido após número satisfatório de tripsinizações, além da análise por Real-Time em um dos grupos. Sendo assim, com a progressão do projeto, a indução será realizada nos demais grupos, assim como a análise quantitativa da expressão das proteínas do leite designadas.