Ajustes de protocolos para a determinação da atividade enzimática antioxidante em miniestacas de Cordia trichotoma (Vell.) Arrab. Ex Steud.

Louro Pardo [C. trichotoma (Vell.) Arrab. ex Steud] é uma espécie florestal cujo uso madeireiro e não madeireiro impulsionam as pesquisas de sua propagação vegetativa. A propagação de miniestacas juvenis é empregada para a propagação dessa espécie, mas tem se mostrado ineficiente na multiplicação por resgate de indivíduos adultos. A fim de avaliar a atividade antioxidante em miniestacas juvenis foram ajustados protocolos para investigação da atividade das enzimas antioxidantes peroxidase (POX), catalase (CAT) e superóxido desmutase (SOD). Como ajuste de protocolo para essas análises, foram testadas a quantidade e o peso das miniestacas por amostra, o tipo de cortes nas estacas antes da maceração, se verticais, longitudinais e a combinação desses, a presença ou ausência de folhas nas miniestacas e a maceração dessas na presença ou ausência de N2 líquido. Foram testados também diferentes preparações do meio de extração das enzimas, a saber: i) com, ou sem 1,4-dithiothreitol (DTT) e fluoreto de fenilmetilsufonil (PMSF); ii) tampão fosfato com pH 6,0, 6,8 e 7,0; iii) diferentes concentrações (1%, 10% e 30%) de polivinilpirrolidona (PVPP) adicionadas iv) diretamente no meio de reação ou sobre as miniestacas, antes da adição do meio e diferentes forças de centrifugação do meio para a obtenção do extrato v) 10.000xg e 12.000xg por tempos diferentes vi) 10 e 15 minutos de centrifugação. Após o teste para ajuste do meio e modo de extração das enzimas foram testados os meios reacionais para cada enzima, a partir de protocolos já estabelecidos para Carica papaya. Como resultado, foi verificado que do mesmo extrato bruto é possível quantificar a atividade de POX, CAT e SOD. O melhor extrato foi obtido a partir de um conjunto de no mínimo 3 miniestacas, com a área foliar reduzida à metade. As mesmas foram cortadas longitudinalmente e, em seguida, verticalmente e maceradas em N2 líquido. Uma amostra de 500 mg do material congelado e macerado foi, novamente, macerado na presença de PVPP 30%, com adição de 5 mL do meio de extração, sendo filtrado em 2 camadas de gaze. O melhor meio de extração contou com a presença de DTT e PMSF e tampão com pH 6,8. Para purificação do extrato, a centrifugação com 10.000xg, por 10 min, apresentou os melhores resultados. Os meios reacionais para a quantificação da atividade das enzimas POX, CAT e SOD não necessitaram de ajustes. Tais resultados possibilitam a montagem de experimentos com o conhecimento da quantidade mínima de miniestacas e com a maximização na preparação do extrato para a quantificação da atividade enzimática.