Soltura de macrófagos peritoneais residentes no perfil de ativação M1 e infecção com Toxoplasma gondii para avaliação da expressão de iNOS na citometria de fluxo

Toxoplasma gondii é parasito intracelular obrigatório de vertebrados e agente etiológico da toxoplasmose. T. gondii infecta células nucleadas inclusive macrófagos. Macrófagos são células heterogêneas derivadas de monócitos circulantes ou de células precursoras embrionárias. No peritônio de camundongos sadios, há duas subpopulações macrofágicas: macrófagos F4/80hi (origem embrionária) e macrófagos F4/80lo (derivados de monócitos). Na peritonite, ocorre a diapedese de monócitos inflamatórios (Ly6Chi). Macrófagos e monócitos ativados no perfil M1 (IFN-γ e LPS) produzem óxido nítrico (NO). NO é um gás microbicida produzido a partir da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS). T. gondii é capaz de modular este sistema microbicida por distintos mecanismos conforme a linhagem de macrófagos. Neste trabalho, avaliaremos se a infecção por T. gondii modula a expressão de iNOS e produção de NO de macrófagos peritoneais murinos perfil M1 originários de condições distintas: macrófagos residentes; e de peritônio estimulado com 200 taquizoitos de T. gondii. Objetivando analisar por citometria de fluxo a expressão de iNOS, iniciamos experimentos para remoção dos macrófagos cultivados por 24h em perfil M1 em placas de 6 poços. Macrófagos residentes peritoneal de camundongos foram ativados em perfil M1 durante 24h. Macrófagos foram soltos com PBS à 4ºC durante 60 min com ou sem raspagem com êmbolo de seringa e foi avaliada a definição da morfologia populacional e viabilidade celular por citometria de fluxo com iodeto de propídio. A remoção de células somente com PBS resultou em 77,3% ± 12,9 de recuperação dos macrófagos plaqueados. Uso de PBS mais raspagem com êmbolo da seringa recuperou 75,7% ± 15,6 dos macrófagos. Macrófagos soltos apenas com PBS apresentaram viabilidade de 72,2 % ± 13,7 e macrófagos soltos com PBS mais raspagem com êmbolo da seringa atingiram 70,9 % ± 11,6. A literatura evidencia a problemática de soltar macrófagos e nossos dados estão de acordo. Portanto, PBS à 4ºC com ou sem êmbolo da seringa apresentaram boa recuperação e viabilidade dos macrófagos ativados. Essa técnica de soltar macrófagos será usada após infecção das células com T. gondii. Macrófagos ou monócitos inflamatórios serão ativados no perfil M1 por 24h e infectados por 2 e 24h. Essas células serão soltas e analisadas por citometria de fluxo para verificar a expressão de F4/80, iNOS e presença de T. gondii. Pretende-se analisar se o mecanismo evasivo de T. gondii contra o sistema microbicida baseado em NO varia conforme a origem de macrófagos primários de camundongos.