Lipídios a partir de microalgas têm atraído a atenção de pesquisadores para produção de biocombustíveis. Vários métodos para a quantificação de lipídios neutros, tais como extração com solvente, requerem um grande volume de amostra e tempo. Neste trabalho, Vermelho de Nilo foi utilizado para avaliar o teor de lipídios em microalgas associado à espectroscopia de fluorescência 2D. O cultivo de microalgas foi realizado durante 10 dias com coleta de amostras a partir do 5° dia de cultivo. O método padrão utilizado para extração de lipídios foi Bright & Dyer. A análise utilizada para caracterização com fluorescência consiste em diluir a amostra em etanol (40°C, 10min), e adicionar solução de Vermelho do Nilo (10 μg/ml em Etanol). Os resultados da quantificação apresentaram R² de 0,96, usando modelos lineares selecionados de acordo com a metodologia PSCM. A metodologia proposta apresentou resultados satisfatórios, permitindo medições rápidas e robustas em menos de 15 min.