A necessidade por combustíveis alternativos faz com que sejam necessárias pesquisas sobre novas fontes energéticas eficientes e não agressivas ao ambiente, e as microalgas tem se apresentado como uma alternativa para a produção de biodiesel. Torna-se então imprescindível a utilização de um método de quantificação lipídica microalgal que seja rápido e confiável. Estudou-se o desenvolvimento de uma metodologia de quantificação lipídica baseada na técnica de Espectroscopia Fluorescente 2D. Modelos quimiométricos foram propostos e calibrados usando soluções de azeite em acetona, medidas de EF2D e seleção multivariável PSCM. Modelos de oito pares de EF apresentaram os melhores resultados na caracterização lipídica, passando para teste em cultivos reais de microalgas em diferentes porcentagens de vinhaça. A aplicação direta do método não apresentou resultados quantitativos aceitáveis, entretanto a tendência foi capturada de forma satisfatória, indicando a viabilidade da técnica proposta.