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Estudos baseados em sequências de DNA e dados citogenéticos revelaram que o complexo P. cuvieri-P. ephippifer possui pelo menos 4 espécies. Entre indivíduos pertencentes a P. ephippifer e à linhagem 1 de “P. cuvieri” (L1), baixa divergência genética foi observada no gene mitocondrial ribossomal 16S (1,4%), mas alta variação citogenética foi encontrada, tendo sido encontrados cromossomos sexuais heteromórficos exclusivamente em P. ephippifer. Para investigar se a variação cariotípica entre essas linhagens pode representar uma barreira reprodutiva, analisamos aqui indivíduos coletados em três sítios localizados entre as áreas de ocorrência dessas duas linhagens. Nesse estudo foram analisadas sequências do fragmento mitocondrial H1 de 46 indivíduos da região de interesse, juntamente com sequências de 88 espécimes pertencentes ao complexo P. cuvieri-P. ephippifer. Dentre os indivíduos de cada um dos três sítios de interesse, foram obtidos dois tipos de haplótipos mitocondriais, distintos em cerca de 1,1%, um deles altamente similar aos encontrados em L1 e o outro muito semelhante às sequências de P. ephippifer. Marcadores RAD-seq agruparam esses mesmos indivíduos de acordo com sua localidade, e todos foram incluídos no clado também composto por amostras de L1 e P. ephippifer. Análises citogenéticas mostraram marcadores exclusivos para os indivíduos da região em estudo, não tendo sido observado qualquer indivíduo com cariótipo híbrido, que reunisse marcadores cromossômicos tanto de P. ephippifer quanto de L1. Esses resultados apoiam o contato secundário entre P. ephippifer e L1, e sugerem que eventos de hibridação ocorridos no passado possam ter favorecido a diferenciação cariotípica nesse grupo.
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