Recuperação e análise de mtDNA de ossos pré-contato europeu

Extração de DNA de restos mortais enterrados apresenta desafios significativos devido ao estado de preservação do material. O genoma mitocondrial (mtDNA) representa apenas uma pequena fração (0,25%) do conteúdo genômico de uma célula, mas apresenta alto número de cópias, sendo assim, muito utilizado em análises com amostras desafiadoras. Esta investigação teve como objetivo obter mitogenomas confiáveis de ossos pré-contato europeu e analisar a eficácia dos métodos utilizados.  Um total de 34 amostras, datação média de 1480 – 390 anos atrás, de sítios arqueológicos no Rio Grande do Sul, Brasil, foram selecionadas. Trabalho laboratorial foi realizado seguindo protocolos de DNA antigo (aDNA) e padrões rigorosos para evitar contaminações externas. DNA foi extraído utilizando um buffer de digestão, seguido pelo uso de colunas de sílica e um buffer de ligação otimizado para DNA ultra-degradado. Bibliotecas foram construídas através de adaptadores específicos da Illumina juntamente com o kit NEBNext DNA Prep Master Mix. A qPCR foi realizada com o kit SYBR green MIX no equipamento LightCycler480. Biblioteca indexada foi purificada com o MagBio High-Prep PCR. Posteriormente, foram quantificadas em um Bioanalyzer 2100 utilizando o High Sensitivity kit. Por fim, foram sequenciadas na plataforma HiSeq 2500 da Illumina. As leituras totais obtidas foram mapeadas com o GRCh38/rCRS. Duplicatas foram marcadas utilizando o Picard MarkDuplicate. Samtools depth foi usado para estimar a profundidade da cobertura. A autenticação do DNA foi avaliada através da análise do padrão de danos, estimando a contaminação através do ContamMix. Como resultado, obteve-se: comprimento médio de leitura: 57,94pb+-8,95; profundidade de cobertura para os pares cromossômicos autossômicos: 6,22+-10,38; profundidade de cobertura para o cromossomo X: 3,88+-7,01; profundidade de cobertura para o mtDNA: 144,75+-148,33; metilação do DNA 5’ C-T: 0,03+-0,05; metilação do DNA 3’ G-A: 0,03+-0,06; metilação do DNA pela 3’ C-T: 0,06+-0,06; contaminação do cromossomo X: 0,02+-0,07; contaminação do mtDNA: 0,98+-0,02; porcentagem média do genoma  considerado autêntico (não contaminado): 0,99+-0,02. Analisando: comprimento médio de leitura: DNA está fragmentado, comum em aDNA; profundidade de cobertura:diferenças na preservação do DNA; valores baixos de metilação: DNA está parcialmente desmetilado, esperado em aDNA; mapeamento de leituras de DNA: alto grau de precisão; porcentagem média do genoma autêntico é alta:maioria do DNA é autêntico. Resultados evidenciam que os métodos aplicados se mostraram eficazes para a extração e análise de mtDNA, mesmo diante das dificuldades inerentes ao estado de preservação do material biológico. Apesar da fragmentação e contaminação típica do aDNA, foi possível alcançar dados com alta autenticidade.