Nos últimos anos tem-se observado o aumento da multirresistência de leveduras patogênicas aos antifúngicos disponíveis no mercado. Isso ocorre principalmente em ambiente hospitalar, causando milhares de casos de morbidade e mortalidade. Diante desta situação, tem-se estudado novas substâncias antifúngicas, capazes de inibir tais patógenos. É o exemplo das micocinas, as quais são definidas como substâncias produzidas por algumas leveduras, a fim de inibir o crescimento de outros microrganismos. Wickerhamomyces anomalus tem se mostrado produtor de altos níveis de micocinas com amplo espectro de ação killer. O objetivo deste estudo constituiu-se em testar a ação antifúngica e tóxica de micocinas produzidas por três cepas de W. anomalus (WA40, WA45 e WA92) isoladas às margens do Lago de Itaipu- Paraná. As micocinas foram obtidas por sobrenadante de cultura e testadas pela técnica de microdiluição em caldo, pelo método M27-A3 - Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008), sobre as leveduras de importância clínica: Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida tropicalis e Cryptococcus neoformans. Resultados satisfatórios foram obtidos utilizando diluições de micocinas de WA40, WA45 e WA92, respectivamente: Candida albicans (1:32; 1:8; 1:4), Candida glabrata (1:32; 1:32; 1:4), Candida guilliermondii (1:4; 1:8; 1:4), Candida tropicalis (1:4; 1:4; 1:4) e Cryptococcus neoformans (1:4; 1:16; 1:8). A análise de toxicidade de micocinas foi realizada comparando com um medicamento já conhecidamente tóxico, a anfotericina B. Para isso, uma solução de eritrócitos a 2% contendo micocinas e outra solução de eritrócitos a 2% contendo anfotericina B, foram incubadas a 37 °C/1 hora, posteriormente foi medida a absorbância dos dois testes, em comprimento de onda de 450 nm e calculado a porcentagem de hemólise. As micocinas apresentaram mínima toxicidade, com hemólise de 0,82% a 8,40% dependendo da cepa testada, já a anfotericina B gerou hemólise de 100% dos eritrócitos. As micocinas de WA40, WA45 e WA92 mostraram possuir um amplo espectro de ação inibitória sobre fungos patogênicos e baixa toxicidade sobre eritrócitos humanos, evidenciando o potencial antifúngico de W. anomalus.