O queijo é um produto de alto valor nutritivo constituído de proteínas, lipídios, carboidratos, minerais, cálcio, fósforo e vitaminas. A maturação é feita sob temperatura e umidade relativa do ar controladas. Devido a estas condições e ser um produto pronto para consumo, pode ser facilmente contaminado por microrganismos, bactérias e fungos, alguns deteriorantes ou patogênicos, levando a uma aparência desagradável, reduzindo o seu valor comercial. A contaminação deve-se a manipulação do produto durante o preparo, bem como falha de higienização de equipamentos e de manipuladores. Entre os patógenos comuns encontrados em queijos, têm-se as E. coli diarreiogênicas (DEC), da família Enterobacteriaceae, que estão associadas contaminação de alimentos e podem apresentar fatores de virulência como adesinas, invasinas e toxinas. O objetivo deste estudo foi detectar genes de virulência de isolados de queijos inspecionados e artesanais produzidos e comercializados em feiras livres e mercados na região sul e sudeste do Brasil. Um total de 147 queijos foram adquiridos e, posteriormente, analisados a fim de isolar colônias de Escherichia coli, a partir de semeadura em Ágar Mac Conkey e identificadas por testes bioquímicos utilizando os meios EPM, Mili e Citrato Simmons. Para detectar os principais genes de virulência foram utilizados dois Multiplex-PCR com modificações e os genes pesquisados foram: ipaH (enteroinvasivas - EIEC), elt e est (Enterotoxigênica - ETEC), aggR (enteroagregativa - EAEC), eae (enteropatogênicas - EPEC), stx1 e em>stx2 (E. coli produtora de Shiga-toxina - STEC). Dos 147 queijos analisados, apenas os queijos artesanais apresentaram colônias de E. coli. Foram isoladas 31 colônias e apenas uma apresentou gene de virulência (eae), indicando pertencer ao grupo das E. coli enteropatogênicas. As demais colônias podem pertencer a microbiota ambiental ou E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC). A presença de E. coli apenas em queijos artesanais mostrou que o tipo de processamento e a higiene que são produzidos são de suma importância para a qualidade do produto e para evitar a contaminação bacteriana e do consumidor.