Testes de simulação in vitro de interação do patógeno com o hospedeiro são essenciais para o entendimento dos mecanismos de virulência do patógeno. Simulações, como o teste de invasão bacteriana em células de linhagem podem elucidar quais isolados são capazes de invadir e se multiplicar nas células do hospedeiro, e esclarecer como o microrganismo é capaz de invadir. Para isso, é importante que o teste seja padronizado de acordo com as linhagens bacteriana e células usadas. A proposta é determinar a concentração ideal de gentamicina para teste com células Vero, sendo que esse antibiótico supostamente não penetra a célula eucariótica. Foram testadas as concentrações de 50, 100 e 200µg/mL de gentamicina, utilizando placa de 24 poços com células Vero na confluência entre 95 e 100%. As linhagens bacterianas usadas foram Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) O152, como controle positivo e E. coli HB101, como controle negativo. Cada concentração foi testada em triplicata com cada bactéria. Poços controle como: apenas células (branco), células + O152 e células + HB101, sem antibiótico, foram testados em duplicata. As células Vero foram mantidas com meio DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antimicrobianos (penicilina 100IU/mL, estreptomicina 100ug/mL, anfotericina B 2,5ug/mL). Obtida a confluência de células necessária para o experimento, os poços foram lavados com salina tamponada 0,01M (PBS) e 50µL de cultura bacteriana incubada overnight em 1mL de caldo LB foram adicionados à placa, seguida de incubação por 3 horas, a 35ºC, sob atmosfera de 5% CO₂. Após incubação, o meio foi retirado e a placa foi lavada a fim de remover as bactérias não invasoras, seguida de adição de DMEM suplementado com as concentrações de gentamicina determinadas. Após incubação de 1 hora, a 37ºC, a placa foi lavada novamente, e as células foram lisadas com 500µL triton 1% e lise mecânica. Então foi realizada diluição seriada e plaqueamento de cada poço em meio ágar MacConkey, seguida de incubação overnight a 37ºC para contagem de colônias. Os resultados indicam que a concentração de gentamicina pode variar entre 50 e 200µg/mL, sem afetar o número de bactérias invasoras. Porém, a maior concentração zerou a contagem de colônias de controle negativo. Por isso, determinamos que 200µg/mL é a melhor concentração para a realização do teste com células Vero.