A preparação de amostras biológicas para microscopia eletrônica de varredura (MEV) geralmente envolve fixação química seguido por desidratação com solventes e secagem. Existem vários métodos de secagem de amostras, no entanto, a mais comum é a secagem ao ponto crítico (SPC). Neste método a amostra é submetida a alta pressão e a consecutivas trocas de solvente, desta forma, podem criar artefatos físicos em amostras frágeis. Outro método utilizado é a secagem química com hexametildissilazano (HMDS). Este método não introduz artefatos adicionais ou distorce as amostras após a secagem, desta forma o material fica preservado com excelentes detalhes de superfície. No presente estudo comparamos os métodos de secagem por HMDS e ponto crítico em biofilme de Lactobacillus fermentum. Para a formação de biofilme foram utilizadas placas de 24 poços contendo lamínulas estéreis de 13 mm de diâmetro revestidas com poli-L-Lisina a 0,1%. O inóculo foi ajustado para turbidez de 0,5 na escala de McFarland em meio caldo de cana (MCC), diluído 1:6 em MCC preaquecido e incubado por 5 h, 37 ºC, 200 rpm. Após esta etapa, foi realizado uma diluição de 1:250, transferido 1 mL para os poços e as placas foram incubadas por 24 h à 37º C. Após a formação de biofilme, as lamínulas foram fixadas em uma solução de 2,5% glutaraldeído e 2% paraformaldeido em tampão cacodilato de sódio 0,15 M (pH 7) por um período de 2 h. Após a fixação, as lamínulas foram pós-fixadas em uma solução de tetróxido de ósmio 1% por 1 h. As amostras foram desidratadas em etanol nas concentrações de 30%, 50%, 70%, 90% e 100% com intervalos de 10 minutos cada. Após, dois métodos de secagem foram utilizados, SPC (BALTEC CPD) e secagem química com HMDS (Sigma Aldrich). Após a secagem as lâminas foram revestidas com ouro e analisadas por MEV (FEI Quanta 200). Os resultados indicaram que os métodos de secagem não causaram alterações morfológicas nas estruturas celulares quando observadas em grandes aumentos. Contudo, foram observados nas avaliações em pequenos aumentos, danos ao biofilme com perda de material quando utilizado SPC. É possível concluir que a secagem de material biológico por HMDS é uma alternativa a ser empregada no preparo de amostras para MEV pelo menor custo e tempo de secagem, dispensa de uso de equipamento e menor estresse físico e estrutural em biofilme bacteriano.