Um grande problema em indústrias alimentícias é a contaminação de superfícies com biofilmes microbianos, os quais podem ocasionar graves problemas de contaminação dos produtos quando presentes em superfícies, devido a falhas nas condições higiênicas e sanificantes aplicadas ao processo. A formação de biofilmes maléficos a saúde humana vem sendo alvo de inúmeros estudos, tanto a respeito de sua composição, da superfície de formação e da influência de fatores intrínsecos e extrínsecos como temperatura, tempo de contato, entre outros. O presente estudo teve como objetivo verificar a formação de biofilme multiespécie composto por Escherichia coli e o Staphylococcus aureus em superfície de aço inoxidável em presença de leite e extrato de carne. Os cupons de aço inoxidável AISI 304#4 foram imersos assepticamente em eppendorfs contendo 1 mL do meio de cultivo (leite ou extrato de carne) e incubados a 25 °C e 35 °C por 24h - 48h para a formação do biofilme. Em seguida os cupons foram imersos em solução salina 0,85%, esterilizada, por 1 minuto para desprendimento de células fracamente aderidas ao cupom. Posteriormente eles foram imersos em uma nova solução salina 0,85%, esterilizada, e submetidos a banho ultrassônico por 10 minutos, após foram realizadas as diluições seriadas e o plaqueamento para a quantificação das células desprendidas. O resíduo de extrato de carne proporcionou a formação do biofilme multiespécie na temperatura de 35 °C, situação que não foi constatada no leite em um período de até 48 horas de contato. Com tais condições propícias foi constatada a adesão e formação do biofilme de ambas bactérias, porém com predominância da espécie Gram-negativa, já que foi verificado uma concentração acima de 7 logs para a E. coli, enquanto que o S. aureus não ultrapassou 5 logs após 24 horas de contato. Concluímos, que o substrato e a temperatura para o desenvolvimento do biofilme multiespécie influenciaram diretamente a sua formação.