Infecção por bactérias multirresistentes é um problema de saúde pública que desafia os profissionais de saúde em ambientes hospitalares. É essencial que novos antimicrobianos sejam desenvolvidos para combater patógenos resistentes aos antibióticos convencionais. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana de óleo essencial de orégano (OEO) e nanopartículas de prata biogênicas, separados e combinados, contra Staphylococcus aureus ATCC 25923. A concentração inibitória mínima (CIM) de cada composto e a interação antibacteriana foram determinadas pela técnica de microdiluição em caldo e pelo Índice de Concentração Inibitória Fracionada (ICIF), respectivamente. O tempo de ação dos compostos foi estudado por curva de crescimento e morte bacteriana. Células de S. aureus tratadas (compostos isolados e combinados) e não tratadas (controle) foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A CIM de OEO e bio-AgNP utilizados individualmente foram 0,596 mg/mL e 250 µM, respectivamente; e a combinação de ambos compostos mostrou atividade antibacteriana sinérgica com CIM de 0,149 mg/mL (OEO) e 62,5 µM (bio-AgNP). Nos tratamentos com os compostos individualmente, a população de S. aureus não apresentou células viáveis após 10 minutos de tratamento com OEO e após 24h de tratamento com bio-AgNP. A combinação de OEO e bio-AgNP mostrou atividade bactericida, eliminando todas as células viáveis após 7 horas de tratamento. O estudo com MEV confirmou a atividade antibacteriana dos compostos em estudo, corroborando com os resultados dos ensaios de microdiluição e de cinética bacteriana, e mostrou que os três tratamentos (OEO, bio-AgNP e OEO combinado com bio-AgNP) reduziram a densidade celular e a quantidade de matriz exopolissacarídica, em comparação ao controle não tratado. Além disso, todos os tratamentos provocaram alterações morfológicas similares, tais como protuberâncias na superfície celular, que sugerem possível extravasamento de conteúdo citoplasmático. A redução de CIM é importante porque diminui o custo do tratamento e reduz eventual toxicidade de algum dos compostos. Além disso, a combinação de antimicrobiano é uma estratégia com potencial para minimizar a evolução de resistência. Desta forma, a associação contendo OEO e bio-AgNP pode ser aplicada em diversos produtos utilizados no setor clínico e alimentício.