O Biofilme consiste em uma comunidade de células bacterianas que crescem aderidos por uma matriz de exopolissacarídeo (EPS) a uma superfície inerte ou viva. Em alguns casos, dependendo das espécies microbianas e ambiente, o EPS pode estar presente como uma cadeia polimérica que envolvem a superfície celular, ou em cordões que interagem entre as células e ainda, em formas helicoidais. A observação real da estrutura do EPS por microscopia eletrônica de varredura (MEV) é de difícil detecção, uma vez que os métodos de fixação mais utilizados não preservam totalmente o conteúdo da matriz, causando vários danos ao material. O objetivo deste estudo foi avaliar por MEV o arranjo da matriz de biofilme formado por Lactobacillus fermentum utilizando corantes catiônicos na solução fixadora. Para a formação de biofilme foram utilizadas placas de 24 poços contendo lamínulas de 13 mm de diâmetro tratadas com poli-L-Lisina a 0,1%. O inóculo foi ajustado para turbidez de 0,5 na escala de McFarland em meio caldo de cana (MCC), diluído 1:6 em MCC preaquecido e incubado por 5 h, 37 ºC, 200 rpm. Após esta etapa, foi realizado uma diluição de 1:250, transferido 1 mL para os poços e as placas foram incubadas por 24 h à 37º C. Após a formação de biofilme, as lamínulas foram tratadas com uma solução fixadora de glutaraldeído 2,5%, paraformaldeido 2% em tampão cacodilato de sódio 0,15 M (pH 7,2) por um período de 2 h. Para o controle foi utilizado a solução fixadora sem a adição de corante e para os tratamentos foram utilizados 3 composição com 0,15 % de cada um dos corante catiônico (T1 vermelho de rutênio, T2 azul de alcian e T3 safranina O). Após a fixação, as lamínulas foram pós-fixadas em uma solução de tetróxido de ósmio 1% por 1 h, desidratadas em etanol (30%, 50%, 70%, 90% e 100%, 10 minutos cada), secas por HMDS, revestidas com ouro e analisadas por MEV (FEI Quanta 200). Os resultados indicaram que todos corantes adicionados ao fixador foram eficientes na preservação do EPS no biofilme, quando comparado com o controle. No entanto, os corantes, vermelho de rutênio e azul de alcian preservaram as estruturas em forma de rede altamente estruturada no biofilme. Este método de fixação pode fornecer imagens de alta resolução da matriz bacteriana permitindo uma visualização dos filamentos altamente estruturado sem a presença de artefatos de técnica.