O uso indiscriminado de antibióticos, os quais são descartados frequentemente no meio ambiente devido à sua incompleta metabolização por humanos e animais que o consomem, está contribuindo ao longo dos anos com o aparecimento de resistência bacteriana. Isto porque o amplo uso desse tipo de antimicrobiano conduz à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes. Portanto, o uso de antimicrobianos de origem natural pode contribuir para a redução da resistência adquirida por esses pequenos organismos e pela manutenção de um ambiente mais saudável. Devido a isto, o presente estudo teve como objetivo avaliar, por meio do teste de difusão em ágar com perfuração de poços, a atividade antibacteriana do extrato hidroalcoólico do Shiitake (Lentinula edodes) individualmente em diferentes concentrações e em associação a antibióticos, frente a cepas de bactérias patogênicas. Importante salientar que tal alimento é um cogumelo comestível, sendo o mais cultivado no mundo, responsável por cerca de 25% da produção mundial. Os microrganismos selecionados para a pesquisa foram: Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923. Amostras de etanol 40% (v/v) e de antibióticos, no caso cefalexina e amoxicilina, foram utilizados como controle negativo e controles positivos, respectivamente. Nos ensaios de difusão em ágar, constatou-se que os extratos hidroalcoólicos, brutos e diluídos (75%, 50% e 25%) com o próprio solvente, inibiram total ou parcialmente o crescimento das duas bactérias testadas. A combinação de amoxicilina e extrato do L. edodes resultou num efeito sinérgico contra S. aureus aumentando a inibição da bactéria, em comparação com os resultados individuais do antibiótico e do extrato. Os resultados deste estudo in vitro mostraram que os extratos hidroalcoólicos do Shiitake apresentam efeitos contra bactérias patogênicas tornando-se uma alternativa como antimicrobiano natural. Os efeitos sinérgicos dos extratos do L. edodes em combinação com antibióticos pode ser de grande valia para potencializar a inibição do crescimento de cepas de E. coli e S. aureus patogênicas e também reduzir a aplicação de doses elevadas de antibióticos na área de saúde humana e animal.