Anais do Congresso de Iniciação Científica da Unicamp
XXIX Congresso de Iniciação Científica da UNICAMP

Bom dia, Jhonatan. Muito obrigado por seus questionamentos.

1. Há diferença entre encapsulação e ligação?

Sim. Os métodos de imobilização podem ser por encapsulação, ou por formação de ligação. A imobilização por formação de ligação pode ser por adsorção física, ligações iônicas e quelação, que são reversíveis, e também por ligações covalentes, que são irreversíveis e mais estáveis. Nos métodos por encapsulação, não há ligação entre o suporte e a enzima, mas esta fica aprisionada no interior do suporte e este permite o acesso do substrato e consequente formação do produto.

2. Quais os parâmetros e os resultados que me mostram que aumentou a estabilidade catalítica? Não ficou claro para mim o que é estabilidade catalítica. 

Existem diversos parâmetros que podem ser utilizados para medir a estabilidade catalítica, a qual pode ser entendida como a capacidade da enzima reter a sua atividade inicial após a incubação em diferentes condições de temperatura, ou quando submetida a ciclos sucessivos de uso. No meu trabalho, utilizamos como parâmetros de estabilidade o tempo de meia vida da enzima e a aplicação em ciclos sucessivos de hidrólise do substrato azocaseína.  A análise comparativa entre os valores de tempo de meia-vida, mostrou que a protease imobilizada foi capaz de reter metade da sua atividade inicial por tempos até 3 vezes maiores que a enzima na sua forma livre na temperatura de 55°C. Ao ser reutilizada durante 6 ciclos sucessivos, a retenção atingiu em torno de 50% após o 3º ciclo, sendo observada queda sucessiva até o fim do 6º ciclo (~30% de retenção).

Muito obrigado pelos elogios, Mariana!
Respondendo as suas dúvidas:

1) Por quê optaram por acrescentar o alginato? Ele também reticula com o glutaraldeído? 

Foi optado por acrescentar alginato devido às suas propriedades físico-químicas. As moléculas de alginato moléculas são bifuncionais, ou seja, possuem duas extremidades altamente reativas (grupos aldeído) que formam ligações covalentes com os grupos amino da enzima e do suporte, formando bases de Schiff. O alginato nesse caso é utilizado para gerar géis mais firmes e resistentes a condições operacionais drásticas favorecendo assim a imobilização de enzimas. Levando em consideração as interações, o alginato possui grupos carregados negativamente em pH neutro que podem interagir com os grupos amina carregados positivamente da quitosana, sendo este o complexo responsável pela formação de uma estratura mais estável.

2) Utilizando a quitosana com ou sem alginato, você poderia fazer a imobilização de outra forma, além da imobilização através de ligações covalentes? Se sim, por que optaram pela imobilização por ligação covalente? 

Sim; existem diversos tipos de imobilização. Em resumo, a imobilização pode ser realizada por formação de ligação por adsorção física, ligações iônicas e quelação, que são reversíveis, e também por ligações covalentes, que são irreversíveis e mais estáveis. Optamos por fazer a imobilização por ligação covalente pois este é um dos métodos mais estudados por se tratar de uma interação forte, havendo pouca ou nenhuma liberação da enzima para o meio em diversas condições operacionais.

3) Você pode afirmar que a temperatura ótima da enzima se manteve após a imobilização, mesmo não tendo estudado temperaturas superiores a 60°C? Não seria interessante fazer uma varredura em diferentes temperaturas e pHs para confirmar os valores ótimos após a imobilização?

É uma colocação muito pertinente. O meu projeto fazia parte de um projeto maior de mestrado que aprofundou mais a caracterização das enzimas imobilizadas. Assim, para uma caracterização mais detalhada, o aluno de mestrado fez ensaios adicionais utilizando um planejamento experimental do tipo DCCR, onde o efeito das variáveis pH e temperatura, assim como os efeitos de interação, foram avaliados em 11 ensaios em uma faixa bem mais ampla que a avaliada no meu trabalho. Os resultados mostraram que a atividade ótima da enzima imobilizada foi mantida em 60°C.

 4) Quais fatores podem ter causado a redução da efetividade observada?

Uma vez que a efetividade é definida como a relação entre a atividade proteolítica da enzima imobilizada e a atividade proteolítica esperada (diferença entre a atividade proteolítica em solução antes e após a imobilização), existem diversos fatores que podem afetar essa redução. Acredito que a sensibilidade da enzima ao processo de imobilização seja um dos fatores mais importantes e a estabilidade pode ter sido afetada pelo tempo de imobilização, pH, temperatura e agitação, além de possíveis efeitos negativos após interação com o suporte. Esses fatores podem ter levado à desnaturação proteica e perda de grupos funcionais, o que reduziu a efetividade observada.

 5) Qual a ordem de grandeza do tamanho das partículas produzidas? Elas seriam de fácil recuperação? O tamanho pode ter alguma influência na atividade enzimática?

Infelizmente não tivemos tempo de realizar esse tipo de determinação. O tamanho pode ter influência sim sobre a atividade enzimática, uma vez que uma relação maior ou menor entre o substrato e a superfície da enzima imobilizada pode facilitar ou dificultar a ligação enzima/substrato e consequentemente a formação de produto.

 6) Ao imobilizar a enzima em um suporte sólido você poderia ter algum tipo de limitação de transferência de massa ou calor? Acabei me empolgando e fazendo muitas perguntas, mas, desde já, obrigada pela atenção!

Com certeza. Falando especificamente de proteases, como os substratos são moléculas grandes (proteínas), dependendo do processo de imobilização, do suporte e das características do produto final imobilizado, pode haver problemas difusionais, dificultando o acesso da enzima ao substrato e consequentemente a obtenção do produto. Assim, a transferência de massa e calor pode ser limitada, o que mostra ainda mais a importância dos estudos com diferentes suportes, métodos de imobilização e condições de ensaios, que são dependentes diretamente das enzimas e das aplicações pretendidas.

Espero ter respondido satisfatoriamente às suas questões e fico à disposição caso tenha mais alguma dúvida.