LONCHOCARPIN IMPROVES 5-FU IMPACTS ON LONG-TERM SURVIVAL AND PROLIFERATION BY INHIBITING THE CANONICAL WNT PATHWAY IN COLORECTAL CANCER CELLS

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  • Presentation type: DR - Doctoral Student
  • Track: 8. Drugs and/or Natural Products Therapy
  • Keywords: Wnt signaling; 5-fluorouracil; Chemoresistance;

Authors:

  • 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Colorectal cancer is the second leading cause of cancer-related death worldwide. The Wnt/β-catenin signaling pathway is strongly linked to colorectal cancer development, progression, and most recently to chemoresistance. The gold standard chemotherapy for colorectal cancer is based on the use of 5-fluorouracil (5-FU) alone or in combination, but the 5-year survival rate remains low. In this context, we are investigating whether the chalcone lonchocarpin is able to sensitize the tumor by inhibiting the Wnt signaling pathway and potentiate the long-term effects of 5-FU treatment on the survival and proliferation of colorectal cancer cell lines. MATERIAL AND METHODS: In this study, we used colorectal cancer cell lines with different degrees of malignancy and status for the Wnt pathway such as the wildtype RKO cells (carcinoma) in addition to the HCT116 (adenocarcinoma Dukes B) and DLD-1 (adenocarcinoma Dukes C) cells, which harbor β-catenin and APC mutations, making the pathway constitutively active. First, we treated the cells for 48 hours with different concentrations of 5-FU and lonchocarpin, both individually or combined. Then, the cells were submitted to various experiments to check the Wnt activity as well as cell proliferation, growth, viability, and survival. RESULTS AND CONCLUSION: First, we showed that lonchocarpin inhibits Wnt/β-catenin signaling in RKO and SW480 in a dose-dependent manner in the W-specific reporter assay. Interestingly, 5-FU only inhibited the activation induced by Wnt3a-conditioned medium at 30 and 100 µM in wild-type RKO cells, but could not inhibited the reporter activity in SW480 cells. We also observed that 5-FU combined with 10 and 20 μM lonchocarpin was more effective in reducing the viability of all cell lines in comparison with 5-FU alone in 48 hours of treatment in the MTT assay. Finally, the combined treatment of 5FU with 10 and 20 µM lonchocarpin was more effective in suppressing cell proliferation and long-term survival than 5-FU alone for all cell lines, especially the wild-type RKO cell. Thus, these data support the hypothesis that Wnt/β-catenin inhibition enhances the effects of the chemotherapeutic 5-FU and can improve the efficiency of anticancer therapies in Wnt-dependent tumors.

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Luiz Fernando Silva Oliveira

Obrigado pelo feedback, professora! 

Estou interessado em avaliar os efeitos da combinação frente a invasão e a transição epitelio-mesenquimal. Durante meus experimentos, observei que o 5-FU alterava a morfologia celular após 48 horas de tratamento. Portanto, pretendo caracterizar essas células usando marcadores de transição epitélio-mesenquimal e invasividade, e avaliar o comportamento delas em comparação ao tratamento combinado de 5-FU e lonchocarpina.

Luciana Souza de Paiva

Perfeito Luiz! Acho que esses ensaios trarão um avanço importante para o seu trabalho. Mais uma vez parabéns e sucesso!

Author

Luiz Fernando Silva Oliveira

Muito obrigado, professora! Sua sugestão será uma importante contribuição para o meu trabalho. 

Author

Luiz Fernando Silva Oliveira

Obrigado pelo feedback, Bruno! 

Suas perguntas são interessantes, e com certeza ajudaram na melhora do trabalho para a futura publicação. Responderei em tópicos para facilitar a discussão. 

1) A hipótese do trabalho atual, é de que a inibição da via Wnt/b-catenina poderia aumentar os efeitos do 5-FU, uma vez que a via Wnt está superativa na maioria dos casos de CCR. Além disso, foi mostrado que o tratamento com 5-FU seleciona uma população de células resistentes, que apresentam fenótipo tronco-like, com genótipo mutante para APC e marcação positiva para LGR5 (Cho et al., 2020). Acredito que usar um inibidor da via que aja a jusante de APC pode aumentar os efeitos do 5-FU a curto e longo prazo. 2) Inicialmente, escolhi o EC20 visando utilizar menores concentrações do 5-FU e poder observar um possível efeito aditivo, sinérgico, ou potencializador da lonchocarpina. Ao meu ver, o EC50 por si, já seria bastante tóxico para as células. 3) Realizei um ensaio de gene repórter específico da via Wnt (dados apresentados no ano passado) e observei que a concentração de 10uM ativava a via, e isso foi coerente ao que vem sendo mostrado na literatura, inclusive por Cho et al. (2020). Como essa concentração (10uM) é próxima do EC50 de todas as linhagens, decidi fixa-la para todos os ensaios posteriores. 4) Talvez. O efeito observado na HCT116 e DLD-1 parece estar ligado a Wnt, pois ambas são mutantes para CTNNB1 e APC, respectivamente. No entanto, a linhagem RKO é selvagem para ambos os genes, mas apresenta dependência da proteína Wnt3a exógena para manter a via de forma ativa. Acredito que o efeito observado nessa linhagem está relacionado a inibição da via mediada pelo ligante Wnt3a, mas pretendo realizar novos experimentos afim de elucidar esse questionamento. 5) Sim, pretendemos, especialmente no ponto de vista molecular. Acredito que isso nos trará respostas importantes que nos ajude a compreender uma forma mais eficaz de utilizar componentes da via Wnt/b-catenina como possíveis alvos terapêuticos no câncer.