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Log inINTRODUCTION AND OBJECTIVES: Pediatric precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common childhood malignancy, accounting for 25% of all childhood cancers. The presence of chromosomal, nucleotide sequence and/or copy number alterations (CNA) are hallmarks of this type of cancer and often correlated with disease prognosis. Recent studies have shown that most of these patients present favorable prognosis, with 5-year overall survival (OS) rates exceeding 90% in various treatment protocols. Furthermore, the cellular responses to damage, as those caused by chemotherapy, depend on DNA repair mechanisms that can counteract those damages, allowing cancer cells to thrive. Single nucleotide polymorphisms (SNP) in the Base Excision Repair (BER), Nucleotide Excision Repair (NER) and Homologous Recombination (HR) pathways can affect the patient’s prognosis for the disease. In this study, we report an abnormally refractory childhood B-ALL case. A 12-years-old boy was diagnosed with common B-ALL, without established abnormalities (B-other), however with an unfavorable clinical evolution and death in less than one year after diagnosis. To refine the clinical characterization of this case, the patient was genetically profiled in terms of mutations affecting key pathways of DNA damage repair, lymphoid differentiation, cell-cycle control and proliferation. MATERIAL AND METHODS: Diagnosis and monitoring of minimal residual disease has been performed by immunophenotyping. Genomic DNA was screened for mutations in APEX1 by direct sequencing. XPD Lys751Gln, XRCC1 Arg399Gln, XRCC3 Thr241Met and RAD51 G135C SNPs were genotyped by PCR-RFLP. CNAs were evaluated by multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) using SALSA MLPA P335-C1 and P202-C1 kits. MLPA data were analyzed by GeneMarker software. RESULTS AND CONCLUSION: Extraordinarily, SNPs in APEX1, XRCC1, XRCC3 and RAD51 were detected. Deletions affecting IKZF1 (exons 2 to 7), CDKN2A (exons 2 and 4), CDKN2B (exons 1 and 2), IGHD and PAX5 (exons 2, 5, 6, 7, 8 and 10) genes were also detected. Because of the co-occurrence of IKZF1, CDKN2A/B and PAX5 deletions, in the absence of ERG deletion, this patient was classified as IKZF1-plus. Aware that DNA repair dysfunctions can result in increased background mutagenesis and chromosomal aberrations, it is possible that the several germline DNA repair alterations contributed to the acquisition of additional somatic deletions ultimately leading to a dismal outcome for the patient. Further studies are needed to better address whether those susceptibility mechanisms might account for the occurence of somatic alterations in any childhood B-ALL.
Dario Eluan Kalume
Oi Marianna,
Gostaria que me explicasse melhor a sentença: "...Furthermore, the cellular responses to damage, as those caused by chemotherapy, depend on DNA repair mechanisms that can counteract those damages, allowing cancer cells to thrive..."
Ao ler a sentença, dá-me a impressão de que o tratamento quimioterápico "nunca" surte efeito na recuperação do paciente, pois parece-me que "todas as células" conseguem se recuperar e neutralizar o dano causado pela quimioterapia. Haveria uma forma melhor de reescrever a sentença?
Isabella Guimarães
Marianna, parabéns pelo trabalho! A apresentação foi clara e objetiva!
Gostaria de fazer algumas perguntas:
1 – Você mencionou no seu relato de caso que o paciente foi classificado pertencente ao subgrupo IKZF1plus, que apresenta um prognóstico bastante negativo. Qual a média esperada de sobrevida para os pacientes categorizados nesse subgrupo?
2 - O paciente em questão foi a óbito em menos de 1 ano após o diagnóstico. Na sua opinião, os SNPs identificados em vias importantes do sistema de reparo de DNA (BER, NER e HRR) contribuíram para esse desfecho? Outros pacientes incluídos no estudo também apresentaram SNPs nessas vias? E existem trabalhos na literatura que corroboram com esse achado?
3 – Você citou na apresentação que alguns estudos ainda estão em desenvolvimento para tentar explicar a ocorrência de alterações somáticas da LLA infantil. Quais estudos adicionais vocês pretendem realizar?
Marianna Villares
Boa tarde, Isabella! Muito obrigada pelos elogios e pela interação.
Questão 1: Até onde conheço, a taxa de sobrevida de pacientes infantis pertencentes aos subgrupo IKZF1-plus é de cerca de 53%.
Questão 2: Sim, acredito que os SNPs em genes de reparo de DNA foram essencialmente influentes na questão da sobrevivência. Não houveram outros pacientes neste estudo, visto que este está sendo um relato de caso, é bastante específico, mas pode nos ajudar no direcionamento futuro para novos estudos e auxílio a novos pacientes. Não existem relatos na literatura sobre esse SNPs nesse genes das vias de reparo de DNA, o que nos permite o processo de patente que está em andamento.
Questão 3: Estamos desenvolvendo um grande trabalho de mapeamento o DNA do paciente, de modo que possamos ter achados inesperados para o quadro dele. Estamos analisando diversas frentes chaves para uma célula existir, como remodelamento de cromatina, metabolismo, reparo de DNA, controle do ciclo celular, queremos entender, por exemplo, o que levou ao surgimento dessas mutações, uma das nossas questões será: um possível descontrole no ciclo celular por ter permitido falhas no processo de reparo o que resultou nas mutações, ou o contrário aconteceu?
Como sempre, a ciência nos dá uma resposta e dez perguntas. Muito obrigada por interagir!
Isabella Guimarães
Obrigada pelas respostas. Tenho mais duas perguntas: 1 - Em relação a sobrevida global (tempo que o paciente permanece vivo após o diagnóstico da doença ou após o início do tratamento) você saberia dizer se o paciente do seu relato de caso estaria dentro do esperado para o subgrupo IKZF1plus? 2 - E o mapeamento citado envolveria NGS?
Marianna Villares
Eu que agradeço!
Questão 1: Na verdade, sim. Alterações em IKZF1 já são conhecidas por representar uma alta taxa de recidivas e má sobrevida.
Questão 2: Infelizmente, não é NGS. Eu não sei de onde você está falando, Isabella, mas aqui no Brasil o NGS é bastante custoso e não possuímos o investimento necessário, então estamos indo em pequenos passos mesmo. Mas chegaremos lá!
Marianna Villares
Fazendo um rápido esclarecimento: era esperado que tivesse uma problemática no desenvolvimento da doença, com base nas alterações em IKZF1, porém não se esperava um desfecho drástico. Acho que acabei por não deixar isso claro na resposta anterior. É importante lembrar que essa pesquisa de IKZF1 ainda não é procedimento padrão, aconteceu porque estávamos num hospital universitário. Uma vez entendido que o paciente é IKZF1-plus, tem um prognóstico negativo e foi introduzido um anticorpo monoclonal, como estratégia terapêutica pro caso específico dele, mas pra surpresa negativa, ele não teve resposta, ou seja, o desfecho foi muito negativo, porque se o tratamento tivesse, pelo menos, reduzido a quantidade de blastos, ele poderia ser direcionado ao transplante, mas infelizmente, não foi possível. Espero ter deixado mais claro agora.
Isabella Guimarães
Sim.. é muito caro mesmo. E agora está bem claro! Toda sorte na sua caminhada!!!
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Marianna Villares
Olá, Dario. Bom dia!
A sentença teve o objetivo de dizer que as células possuem mecanismos de reparo de DNA, e os danos causados por qualquer razão, incluindo a quimioterapia, deveriam ser reparados, o que permitiria, dessa maneira, o avanço do câncer. Portanto, os efeitos da quimioterapia são dependentes das respostas celulares aos danos resultantes desta, ou seja, se houver reparo, os danos são neutralizados e não se vê o efeito da quimioterapia.
Um fato importante é que o paciente infantil em questão, não obteve resposta do tratamento quimioterápico, e sendo este, um work in progress, ainda buscamos responder qual a razão do paciente não ter tido bons resultados com a quimioterapia.
No entanto, concordo que a sentença poderia ter sido melhor elaborada. Algo como "a depender das respostas celulares frente ao dano causado pelo tratamento quimioterápico, as células cancerosas podem, ou não, obter êxito", por exemplo.
Obrigada pelo seu questionamento.
Havendo ainda qualquer dúvida, estou à disposição.
Dario Kalume
Obrigado pela otima resposta, e minhas congratulações pelo seu belo trabalho. E tenho maiis perguntas:
Marianna Villares
Olá, Dario. Um prazer responder as questões.
Questão 1: O PCR-RFLP se dá em algumas etapas, as quais são extração de DNA, fragmentação do DNA e eletroforese em gel. Uma vez o DNA extraído, ele é cortado por endonucleases em loci específicos, em fragmentos curtos de DNA que variam de pessoa pra pessoa (VNTRs) que serão amplificados e, na eletroforese, serão separados por tamanho e carga. Este método se aplica na detecção de alterações genéticas e teste de paternidade, por exemplo.
Questão 2: Não foram detectadas alterações cromossômicas no paciente infantil, alvo do estudo.
Questão 3: Painel completo de LLA-B infantil do grupo Enroflow.
Questão 4: Esse estudo é um relato de caso, desse modo, está sendo desenvolvido para compreender o desenvolvimento desse caso. Porém, acreditamos que com as respostas obtidas nesse estudo, poderemos basear os conhecimentos para auxiliar novos pacientes e ajudar futuramente com um novo tratamento, se possível.
Obrigada pela interação, Dario.
Dario Kalume
Obrigado e Parabens