RESISTANCE TO PACLITAXEL INDUCES GLYCOPHENOTYPE CHANGES AND EPITHELIAL-TO-MESENCHYMAL TRANSITION ACTIVATION IN A HUMAN PROSTATE CANCER CELL LINE

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  • Presentation type: Pós-Doutorado
  • Track:
  • Keywords: multidrug resistance phenotype; epithelial-mesenchymal transition; atypical glycosylation; human prostate adenocarcinoma; glycophenotype;
  • 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: The development of the multidrug resistance phenotype (MDR) is one of the major challenges faced in the treatment of cancer. The MDR phenotype is characterized by cross-resistance to drugs with different chemical structures and mechanisms of action. In this work, we hypothesized that the acquisition of resistance in cancer is accompanied by activation of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process, where the tumor cell acquires a more mobile and invasive phenotype; a fundamental step in tumor progression and in promoting the invasion of other organs and tissues. In addition, it is known that atypical glycosylations are characteristic of tumor cells, being used as biomarkers. The goal of this study was to show whether the acquisition of the MDR phenotype and activation of EMT would provoke alterations in the cell glycophenotype, which can be used as glycomarkers for chemoresistance and EMT processes. Herein, we induced the MDR phenotype in the PC-3 human prostate adenocarcinoma line through the continuous treatment with the drug paclitaxel. MATERIALS AND METHODS: To evaluate cell viability and the emergence of an MDR phenotype we used MTT and Annexin/ PI assays. Western Blot, flow citometry and RT-qPCR assays were used to evaluate protein expression and gene activation. Flow cytometry was used to evaluate the expression of glycan epitopes. RESULTS AND CONCLUSION: Our results showed that an MDR phenotype was successfully induced, with the cells (i) acquiring a mixed profile between epithelial and mesenchymal phenotypes; (ii) and presenting a modified glycophenotype, showing an increase in the level of sialylation and in the number of branched glycans. Both mechanisms are described as indicators of poor prognosis

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Leonardo Fonseca

Boa tarde Bruno, obrigado pelos elogios. Espero que o vídeo realmente tenha ajudo. Eu gostaria de ter feito algo um pouco mais didático, mas o tempo máximo do vídeo era bem curto. Vamos às perguntas: 1. Quando eu comecei o trabalho com outro colega do laboratório, nós pegamos 2 linhagens cada um e começamos o processo de indução de resistência com 2 quimioterápicos pra cada linhagem. Eu havia escolhido na verdade uma outra linhagem, que era a A549 de câncer de pulmão que tinha um comportamento bem padrão quanto à transição epitélio-mesenquimal, em comparação com a PC-3 (eu já havia ouvido relatos em conversas de que o comportamento delas bate com o que encontramos aqui. Além disso eu cheguei a usar um outro quimioterápico. Esse foi o modelo que deu resultado mais rapidamente. Eu ainda pretendo voltar à ideia original e comparar mais de uma linhagem, de preferência usando o mesmo quimioterápico e avaliar o efeio de uma mesma droga em linhagens diferentes. 2. Eu cheguei a fazer com um ex-aluno de graduação um PCR pra vimentina e b-catenina. Os dois ficaram aumentados, mas como foi um experimento só e depois começou a pandemia, eu preferi focar no que já estava feito pra fechar tudo e publicar o artigo. Ocludina e claudina não foram feitos pq não tinha na época no laboratório os primers ou anticorpos. Além de b-catenina e vimentina nós também íamos testar de cara snail e slug, mas acho que ele teve um problema no dia e não inclui esses. Mas esses resultados vão acabar incluídos em outro trabalho.  3. A expressão de glicosiltrasferases já está sendo bastante estudada por vários grupos e as alterações que nós observamos no nosso modelo já foram observadas em outros trabalhos. A alteração de GNT-3 e GNT-5 foi bem descrita em células de câncer de estômago por um grupo do Porto e vários grupos já reportaram alterações nos níveis de sialilação ao induzir resistência. O que moveu o nosso grupo a realizar esse trabalho foi a ideia de que esses eventos de aquisição de resistência e mudança de fenótipo estariam certamente interligados e um dos principais "fios de ligação" poderia justamente ser a alteração do glicofenótipo. Resta descobrir se essas alterações estão mais ligadas a esses eventos como causa ou efeito. De qualquer modo a aplicação mais imediata não só pare esses resultados, mas para os resultados semelhantes de outros grupos é o investimento em glicobiomarcadores para testes diagnósticos, que possam ser usados pra prever com mais rapidez o prognóstico de um tumor, que é um campo que vem crescendo bastante nos últimos anos.      

Bruno Ricardo Barreto Pires

Perfeito, Leonardo. Voce respondeu bem a todas as perguntas. Novamente, parabens pela publicacao. Um abraco, Bruno.
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Leonardo Fonseca

Oi Eliane, obrigado pelos comentários. Vou ser sincero e dizer que nem pensei nisso, até porque a única linhagem de próstata que temos no laboratório é a PC-3. Mas parece ser uma boa ideia já que a resposta a andrógenos afeta o crescimento e o potencial metastático. É possível que os as alterações sejam diferentes ou que haja um certo sinergismo com o efeito hormonal.

Eliane Gouvêa de Oliveira-Barros

Eu tenho trabalhado com PCa desde o mestrado e, de fato, essas linhagens respondem de maneira bem distinta aos estímulos e tratamentos. Acredito que essa linhagem PC3 que você está usando tenha inclusive sido cedida pelo Laboratório do Professor Luiz Eurico Nasciutti (meu orientador de mestrado e de doutorado), pois cheguei a fazer alguns testes em linhagens de PCa com o Leonardo Freire. Caso vocês tenham interesse em aprofundar esse estudo com outras linhagens de PCa (DU145, metastática cerebral; LNCaP, metastática em linfonodo; RWPE-1, linhagem de próstata normal), podemos conversar melhor. Digo isso porque resultados obtidos com apenas um tipo celular são delicados, principalmente devido a grande heterogeneidade do PCa. 2 - A figura 6 A mostra a expressão RNAm de marcadores de EMT. Nessa figura é possível observar, após o tratamento, uma maior expressão de fibronectina (marcador mesenquimal) e também de e-caderina (marcador epitelial), concomitante a uma menor expressão de n-caderina (marcador mesenquimal). Esse resultado é reforçado pela análise da expressão proteica de e-caderina e n-caderina  (figura 6 B). A partir desses resultados considero delicado falar em ativação do processo de EMT, principalmente considerando que in vitro essas linhagens de PCa tendem a aumentar a expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina e vimentina (que vc mesmo já observou aumento de expressão). Assim, acredito que realmente será bastante enriquecedora as análises dos padrões de expressão dos fatores de transcrição Twist, Snail, Slug. 3 -  Na conclusão vocês se referem a um glicofenótipo modificado, com aumento na sialilação de superfícies de células tumorais e da expressão de glicanos truncados, o que pode ser indicativo de um fenótipo mais agressivo. Certo? Gostaria que você comentasse um pouco mais a esse respeito uma vez que o ácido siálico é fisiologicamente encontrado em abundância em tecidos animais e é crucial para diversas funções celulares.
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Leonardo Fonseca

Eu acho que o Leonardo Freire pegou essas células com a professora Cristina Takyia, mas é possível que ela mesmo tenha pego com vocês. De qualquer modo eu tenho a impressão de que cheguei a pegar um criotubo com você mesma uma vez, em 2018, creio. Você tem toda a razão quanto a resultados com uma linhagem apenas. Na verdade esse era meu principal receio quanto à publicação do trabalho. Então o uso de outras linhagens, principalmente de próstata para expandir o modelo e complementar os dados seria excelente. Uma colaboração seria ótima. Ácido siálico como vc bem pontuou é essencial para inúmeras funções, incluindo resposta imunológica. Uma cosa que eu tenho visto nos trabalhos sobre linhagens tumorais quimioresistentes é que o aumento da expressão de sialitransferases é um tema recorrente, principalmente com relação à ST3Ga1 e ST6Gal1, então seria um aumento da expressão de epítopos sialilados tanto em ligação do tipo alfa-2,3 quanto 2,6. Esses resultados já foram mostrados em vários tipos de câncer, por PCR e tb usando lectinas e anticorpos para epítopos específicos. Até pela importância grande dessas enzimas em funções essenciais, o uso de inibidores como forma tratamento não tem futuro, a não ser combinado com sistemas mais sofisticados de "drug-delivery" pra que a ação seja bem localizada. Mas a implicação desse tipo de alteração para biomarcadores e sistemas de diagnóstico é algo bem mais imediato e simples de alcançar. Não sei era bem isso que você estava pensando.

Eliane Gouvêa de Oliveira-Barros

Sim, são as mesmas células. A Prof. Christina é uma importante colaboradora em meus trabalhos. Provavelmente você pegou as células comigo também... Atualmente, estou na UFJF, o Léo tem o meu contato para caso vocês realmente queiram conversar melhor! A oportunidade de manter o contato com vocês é ótima. Quanto ao ácido siálico eu estava realmente pensando no que você pontuou, principalmente em relação à limitação para o uso de inibidores. Obrigada pelos esclarecimentos. Mais uma vez, parabéns! Estarei torcendo pelo seu sucesso!

Eliane Gouvêa de Oliveira-Barros

Pequenos detalhes: No pôster,  as figuras 7 e 8, são na verdade, a mesma figura duplicada? Não encontrei a figura 9!
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Leonardo Fonseca

Ah que bom. Seria ótimo sim. Eu acho que peguei com vc sim, até na época que vc estava grávida. Acho que era vc pq me lembro do nome. De qualquer forma, quanto ao uso de inibidores eu vejo essa questão do mesmo jeito que o uso de inibidores para transportadores ABC. Na primeira década do século, a corrida era pra descobrir um inibidor que pudesse ser usado na clínica para reduzir resistência e eu não me esqueço da minha antiga orientadora falando que isso era perda de tempo do jeito que estava sendo feito porque esses transportadores estão em todas as células. Isso só começou a ganhar alguma tração real quando foi associado a drug-delivery. 
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Leonardo Fonseca

Eu acho que realmente saiu errado e ninguém percebeu. Quanto à 9, como eu acabei cortando figuras devo ter pulado na hora de numerar.