OXYRESVERATROL INDUCES APOPTOSIS VIA CASPASE-3 IN MDA-MB-231 BREAST CANCER CELLS

Favorite this paper
How to cite this paper?
Details
  • Presentation type: Doutorado
  • Track:
  • Keywords: Oxyresveratrol; MDA-MB-231; Caspase 3; Breast cancer; Natural products;
  • 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro

Please log in to watch the video

Log in
Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Breast cancer is the second most common type of cancer in the world, and the one responsible for most deaths in women. The process of carcinogenesis comprises the initiation, promotion and tumor progression, and it has been shown that natural products may act at these different stages. Oxyresveratrol (trans-2, 3’, 4, 5’-tetrahydroxystilbene; OXY) is a polyphenol found mainly in the Morus alba L. belonging to the family Moraceae and has several biological effects describes as leishmanicidal, anti-oxidant and anti-inflammatory. The aim of this study was to investigate the effect of OXY in cell death of in MDA-MB-231 breast cancer cell. MATERIAL AND METHODS: The phases of the cell cycle were analyzed in flow cytometry after labeling with RNAse-PI. The analysis of apoptosis and necrosis were conducted with annexin V-FITC and PI by flow cytometry and the confirmation of apoptotic cells was done using DAPI staining. To determine the effect of OXY on MDA-MB-231 cells, caspase-3 involved in apoptosis was analyzed by Western Blot, Immunocytochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). RESULTS AND CONCLUSION: Our results showed that OXY presented cytotoxicity in MDA-MB-231 cells with IC50 of 287.08 µM after 24 hours of treatment. To further examine the cytotoxic effects of OXY over a prolonged period of time, clonogenic assays were performed cell for 18 days after treatment with IC50. Our data showed that the clonogenic ability of MDA-MB-231 cells was inhibited in the presence of 287.08 µM of OXY. The OXY increased by 3-fold the percentage of annexin-V positive cells, which characterizes apoptosis death. To further confirm the mode of cell death, the MDA-MB-231 cells were assessed by DAPI staining. Our results demonstrated that after incubation with 287.08 μM OXY for 24 hours, the apoptotic cells increased 2.48-fold. Our immunocytochemistry results showed that OXY increased 3.47-fold the levels of caspase-3. In addition, OXY induced significant upregulation of caspase-3 demonstrated by RT-PCR and Wester Blot results. In summary, our results demonstrated the in vitro anti-breast cancer effect of OXY, which may suggest an important candidate for the source of new molecules to be used in anticancer therapy.

Questions (2 topics)

Share your ideas or questions with the authors!

Did you know that the greatest stimulus in scientific and cultural development is curiosity? Leave your questions or suggestions to the author!

Sign in to interact

Have a question or suggestion? Share your feedback with the authors!

Author

Carlos Luan Alves Passos

Olá Giselle, muito obrigado! Desconheço dados na literatura que quantificaram o rendimento de OXY na amora, porém, há uma variação de compostos fenólicos totais no fruto, que pode ser de 300 a 500 mg/100 g dependendo da amostra. No entanto, foram observados que a quantidade de OXY presente tanto no fruto quanto no caule e raiz da amoreira, vão depender principalmente das condições de plantio, solo, tempo de exposição ao sol e outros fatores que irão favorecer a produção deste metabólito. Nós avaliamos o efeito do OXY em células normais de mama MCF-10A, linhagem de macrófagos RAW 264.7 e também fizemos ensaios de hemólise com sangue de doadores saudáveis, em todos os casos, o efeito citotóxico foi menor do que o observado nas células de câncer de mama. Não testamos em outros tumores, mas na literatura já foi demonstrado o efeito em células de neuroblastomas, bexiga, e no câncer colorretal. Desconheço resultados de ensaios clínicos com o OXY, no entanto, como a estrutura química possui uma hidroxila a mais do que o resveratrol, a solubilidade é melhorada, Com isso ele é absorvido e eliminado mais rapidamente, sendo vantajoso se pensarmos na utilização como nutracêutico, administrado por via oral. Os estilbenos, geralmente sofrem metabolização de fase II, o mesmo acontece com o OXY, porém alguns trabalhos demonstraram que essa metabolização é mais lenta e a concentração plasmática dura mais tempo do que outros compostos da mesma classe. A justificativa seria que a posição das hidroxilas na estrutura cria uma estabilidade metabólica. Em relação ao efeito in vivo, já iniciamos os testes e observamos que os animais toleram bem o OXY, não observamos sinais de toxicidade e vimos à redução do tamanho dos tumores de mama, porém, com a pandemia paramos com os experimentos. O OXY já foi sintetizado, e o que utilizamos nos nossos ensaios foi comprado da empresa SIGMA.  
Author

Carlos Luan Alves Passos

Olá Isabella, muito obrigado!
  1. Os ensaios prosseguiram para as duas linhagens de câncer de mama humano e também em uma linhagem de câncer de mama de camundongo, porém com a limitação do espaço, optei em apresentar o efeito nas células MDA-MB-231 por ser mais agressiva quando comparada a MCF-7.
  2. O controle é tanto com células não tratadas e tratadas com o DMSO a 1% que não apresenta toxicidade na concentração testada. Para a viabilidade celular, foram mantidos os resultados do controle de células não tratadas, porém não há diferença estatística entre o controle não tratado e o DMSO. A porcentagem de DMSO é 1%, irei acrescentar para as próximas apresentações.
  3. Sim. Observamos uma maior expressão de caspase-3 pelo qPCR quando tratado com OXY, porém, precisamos fechar esses resultados. Para o Western-blot, tivemos bastante dificuldade e fizemos experimentos tanto com a caspase-3 quanto com a caspase-3 clivada, mas não ficaram bons, por esse motivo partimos para a imunocitoquímica e o qPCR.  Já é descrito que a doxorrubicina aumenta os níveis de caspase-3, como observado na figura 6A. Pode ser que haja um aumento da atividade e não da expressão de caspase quando tratados com a DOX na concentração testada, no entanto, precisamos de mais experimentos para fechar os resultados do qPCR.
  4. Para avaliação da apoptose, inicialmente realizamos o ensaio de ciclo celular, e observamos um aumento da marcação de células na fase Sub-G0/G1 o que é sugestivo para a morte por apoptose. Para confirmar esse achado, realizamos o ensaio de PI/ANEXINNA-V e posteriormente fomos investigar quais proteínas possivelmente estariam envolvidas na morte dessas células, para tal realizamos as três metodologias, que são bem aceitas na literatura para descrever as vias relacionadas na morte celular. Porém, estamos tentando elucidar se outras proteínas estariam participando também na apoptose das células, como a BAX e BCL-2. Em todos os artigos que utilizei como referência para construir os primers para o qPCR, utilizaram a caspase-3 e na imunocitoquímica, pretendemos sim realizar os experimentos utilizando a caspase-3 clivada.
 

Isabella Guimarães

Obrigada pelas respostas!! E novamente parabéns pelo trabalho!

Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida

Oi Carlos, parabéns pelo trabalho! Aproveitando o gancho da Isabella, gostaria de complementar a discussão sobre a caspase-3. Concordo que a anexina-V é um importante método para detecção de apoptose, porém seu título faz referência à dependência de caspase-3 na morte celular observada pelo oxyresveratrol. E nesse caso, o aumento da expressão de caspase-3 não significa a ativação da via. A ativação de caspase-3 requer processamento proteolítico do zimogênio inativo (~35 kDa). Para isso, você pode usar anticorpos que detectem diretamente os fragmentos de 17/19 kDa ou a clivagem de PARP, que é uma proteína downstream e alvo de clivagem da caspase-3. Abraços!
Author

Carlos Luan Alves Passos

Olá Vitor, muito obrigado! Agradeço muito a sua sugestão. A PARP-1 é outra proteína que estamos investigando, assim como a BAX e BCL-2 por qPCR e Imunocitoquímica. Abraços.